焦緒勇，張晗，尚云曉，何夢博，王莉，王桂珍

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)教研室，沈陽110001）

肺炎支原體感染對BALB/c小鼠肺組織半胱氨酰白三烯及其受體表達(dá)的影響

焦緒勇1，張晗1，尚云曉1，何夢博2，王莉1，王桂珍2

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物學(xué)教研室，沈陽110001）

目的探討肺炎支原體（MP）感染對BALB/c小鼠肺組織半胱氨酰白三烯（CysLTs）及其受體（CysLTs-R）表達(dá)的影響。方法100只BALB/c小鼠隨機(jī)分成肺炎支原體感染組（MP組）和PBS對照組（N組），每組50只，分別于接種后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d從各組中取5只小鼠，取其肺組織，收集肺泡灌流液（BALF），用ELISA試劑盒檢測CysLTs的含量；同時將肺臟固定于中性甲醛中，制作病理切片，HE染色觀察病理組織學(xué)變化；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測CysLTs-R的表達(dá)情況；用Western blot實驗檢測肺組織中CysLTs-R的表達(dá)變化。結(jié)果病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，MP感染BALB/c小鼠3 d后，即出現(xiàn)間質(zhì)性炎癥改變，7 d后炎癥明顯，14 d后炎癥逐漸減輕并于30 d時基本消退；ELISA檢測結(jié)果表明，與N組比較，MP組BALF中CysLTs含量明顯增高（P＜0.05），于感染后7 d和14 d達(dá)到高峰，而后呈下降趨勢；免疫組化結(jié)果顯示，在MP感染后，CysLTs-R蛋白在氣管上皮細(xì)胞表面的表達(dá)增強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示MP組小鼠于感染后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d，肺組織中CysLTs-R蛋白的表達(dá)量均高于N組。結(jié)論MP感染可以顯著增加正常BALB/c小鼠中CysLTs及CysLTs-R的表達(dá)水平。

肺炎支原體；半胱氨酰白三烯；半胱氨酰白三烯受體；BALB/c小鼠

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）感染引起的原發(fā)性非典型肺炎，其主要感染兒童和青少年［1］。MP感染可以促進(jìn)細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及生長因子等的釋放，從而介導(dǎo)氣道炎癥和免疫反應(yīng)［2］。隨著人們對氣道炎癥研究的深入，白三烯（leukotriene，LT）及其受體在氣道炎癥和免疫反應(yīng)中的作用越來越得到重視［3］。研究顯示，LT在體內(nèi)含量雖微，但是卻有很高的生理活性，并且是某些變態(tài)反應(yīng)、炎癥以及循環(huán)、呼吸系統(tǒng)等疾病中重要的化學(xué)介質(zhì)，其中半胱氨酰類白三烯（CysLTs）具有很強(qiáng)到收縮作用，可激活大部分白細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞脫顆粒，中性粒細(xì)胞滲出，并能夠促使白細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮和血漿外滲，從而參與氣道炎癥的發(fā)病過程［4］。新近研究表明，嬰幼兒喘息性疾病的血、尿中LT濃度呈持續(xù)增高的狀態(tài)［5］。而在MP感染中LT及其受體的變化以及LT是否介導(dǎo)其炎性反應(yīng)的報道較少。本實驗旨在探討MP感染對小鼠肺組織中CysLTs含量及CysLTs-R表達(dá)的影響，為MP感染機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組：100只SPF級BALB/c小鼠，4～6周齡，體質(zhì)量14～16 g，雌雄各半，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分成MP感染組（MP組）和PBS對照組（N組），每組50只。

1.1.2 主要試劑與儀器：MP國際標(biāo)準(zhǔn)株由中國醫(yī)科大學(xué)病原微生物教研室提供；CysLTs ELISA試劑盒購自美國R&D公司；兔抗小鼠CysLTs受體抗體和羊抗兔多克隆二抗為Abcam公司產(chǎn)品；免疫組化染色試劑盒購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 肺炎支原體的接種：MP組50只BALB/c小鼠，用10%水合氯醛（0.05 mL/只）腹腔注射麻醉，參考文獻(xiàn)［2］方法，每只小鼠滴鼻接種濃度為1×108CCU/mL MP菌液20 μL，將小鼠的頭后仰30～45°，隨小鼠的自然呼吸動作，MP菌液到達(dá)下呼吸道。N組50只小鼠以等量的PBS代替MP菌液給小鼠滴鼻接種。

1.2.2 標(biāo)本采集與保存：分別于接種后3 d、7 d、14 d、21 d和30 d從各組中取5只鼠，10%水合氯醛麻醉，心尖取血，分離血清，-80℃保存。分離頸部氣管，結(jié)扎右主支氣管，氣管插管約0.2 cm，分3次從氣管插管處緩慢注入4℃預(yù)冷的PBS溶液進(jìn)行支氣管灌洗，每次0.5 mL，保留30 s緩慢回抽，收集全部支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），4℃2 000 r/min離心10 min，取上清-80℃冰箱凍存。完整分離心肺組織，結(jié)扎右肺支氣管，迅速取下右中肺，置于中性甲醛中，其他右肺組織放入EP管中-80℃凍存。

1.2.3 檢測指標(biāo)：應(yīng)用ELISA檢測試劑盒對采集的BALF中CysLTs含量進(jìn)行檢測，具體步驟按說明書進(jìn)行，顯色后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算CysLTs相對含量。取固定于甲醛的組織，制作病理切片，一部分進(jìn)行HE染色觀察其病理組織學(xué)變化，另一部分用免疫組織組化方法檢測肺組織中CysLTs-R蛋白的表達(dá)情況。進(jìn)一步用Western blot法檢測肺組織中CysLTs-R蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

各組實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料均以表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊時采用LSD檢驗；方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)變化（圖1）

圖1 各實驗組BALB/c小鼠肺臟病理組織學(xué)結(jié)果×400Fig.1 The lung histopathological results of BALB/c mice in each group×400

N組肺泡結(jié)構(gòu)較為均勻與清晰，肺泡內(nèi)無滲出，偶見淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤在支氣管和血管周圍及肺泡中（圖1A）；MP感染BALB/c小鼠3 d后，肺泡內(nèi)有滲出物，肺泡間質(zhì)增寬，有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤（圖1B）；MP感染BALB/c小鼠7 d后，肺泡間質(zhì)明顯增寬，在支氣管和血管周圍及肺泡間質(zhì)中有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤（圖1C）；MP感染小鼠14 d后，肺泡間質(zhì)稍有增寬，淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤減少（圖1D）；MP感染小鼠21 d后，可見肺泡間質(zhì)稍有增寬，有少量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤（圖1E）；MP感染BALB/c小鼠30 d后，在支氣管、血管周圍可見少量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤（圖1F）。

2.2 肺組織中CysLTs-R蛋白的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果如圖2A所示，各組均見有棕黃色顆粒表達(dá)，主要表達(dá)集中在各級支氣管（細(xì)支氣管、終末細(xì)支氣管和呼吸性細(xì)支氣管）的氣道上皮細(xì)胞。進(jìn)一步用圖像分析軟件（NIS-Elements Br 3.0）對CysLTs受體陽性部位進(jìn)行原位定量檢測，得到光密度（OD）值，結(jié)果如圖2G所示，同N組比較，MP組各時間點(diǎn)CysLTs-R表達(dá)信號均顯著增加（P＜0.05），于MP感染后第14天陽性信號最強(qiáng)，而后于21 d起逐漸減弱。

2.3 CysLTs含量的檢測

圖2 CysLTs?R蛋白在各組小鼠支氣管和肺組織的表達(dá)Fig.2 The expression of CysLTs?R protein in bronchus and lung tissues in mice of each group

用ELISA試劑盒對各實驗組BALF中的CysLTs含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。與對照組比較，MP組于各時點(diǎn)CysLTs含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較顯示，MP組中CysLTs含量從感染后第3天起即上升，于感染后第14天達(dá)到高峰，但2者差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），21 d后逐漸下降，與第14天比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠BALF中CysLTs含量的變化Fig.3 The content changes of CysLTs in BALF of mice from each group

2.4 CysLTs-R蛋白表達(dá)分析

用Western blot對肺組織中CysLTs-R蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，在感染MP后，第3天、第7天、第14天、第21天、第30天CysLTs-R蛋白均較正常對照組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

肺炎支原體肺炎是由肺炎支原體引起以間質(zhì)病變?yōu)橹鞯募毙苑尾扛腥?，其發(fā)病率逐年遞增，流行病學(xué)調(diào)查顯示，在美國，30%社區(qū)獲得性肺炎患者系MP所致［6］。我國MP感染所致肺炎占小兒肺炎的10%～20%。MP已成為小兒下呼吸道感染的重要病原，其發(fā)病無季節(jié)性，在封閉人群中，MP可產(chǎn)生小規(guī)模的流行［7］。MP所致上呼吸道和下呼吸道感染與年齡有關(guān)系，3歲以下幼兒以上呼吸道感染為多，5～20歲年齡組人群以支氣管炎和肺炎為主要表現(xiàn)，成人則以肺炎多見［8］。本研究結(jié)果顯示小鼠經(jīng)MP接種后，于第3天即出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)，7 d后炎癥明顯，14 d后炎癥逐漸減輕并于30 d時基本消退，提示小鼠經(jīng)MP接種后出現(xiàn)以炎性反應(yīng)為特征的病變，其結(jié)果與文獻(xiàn)報道［2］基本一致。目前研究顯示MP的發(fā)病與免疫機(jī)制密切相關(guān)，多種細(xì)胞因子在其發(fā)病過程中起重要作用［9］。隨著對該病研究逐步深入，LT及其受體家族在氣道炎癥和免疫反應(yīng)中的作用越來越得到重視。

圖4 CysLTs-R蛋白表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of CysLTs-R protein in each group

LT是花生四烯酸經(jīng)5-脂氧合酶途徑合成的一類炎性介質(zhì)，發(fā)揮生理作用是通過特定的受體，即白三烯受體而產(chǎn)生的，而哮喘的白三烯介導(dǎo)途徑主要是通過CysLTs受體產(chǎn)生的［10］。CysLTs在體內(nèi)含量雖微，但是卻有很高的生理活性，并且是某些變態(tài)反應(yīng)、炎癥以及循環(huán)、呼吸系統(tǒng)等疾病中的重要的化學(xué)介質(zhì)，其中LTC4、LTD4、LTE4都是很重要的炎性介質(zhì)和強(qiáng)氣道、血管收縮劑，白三烯對支氣管的收縮作用是組胺的1 000～10 000倍［11］。

MP感染刺激多種細(xì)胞和細(xì)胞組分（肥大細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）釋放了一系列細(xì)胞因子和黏附分子浸潤氣道，引起氣道持續(xù)性炎癥和氣道的重建。一些研究認(rèn)為，MP感染致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠可以使其氣管支氣管黏膜下層出現(xiàn)膠原蛋白沉積而導(dǎo)致氣道重塑，從而引發(fā)更為嚴(yán)重的氣道反應(yīng)性增加和哮喘癥狀［12］。亦有實驗報道MP感染患兒血清白三烯、尿白三烯水平明顯高于正常對照組［13］。本實驗深入研究了MP感染的BALB/c小鼠不同時間點(diǎn)BALF中CysLTs和肺組織CysLTs-R在氣管和肺組織的表達(dá)情況。ELISA檢測結(jié)果表明，與正常組比較，MP組BALF中CysLTs含量明顯增高（P＜0.05），于感染后7 d和14 d達(dá)到高峰，而后呈下降趨勢；免疫組化結(jié)果顯示，在MP感染后，CysLTs-R蛋白在氣管上皮細(xì)胞表面的表達(dá)增強(qiáng)；Western blot結(jié)果顯示不同感染組中CysLTs-R蛋白的表達(dá)量均高于正常對照組。由此可見，MP感染小鼠后CysLTs-R在肺組織中的表達(dá)呈先升高后降低的波動過程。

綜上所述，MP感染BALB/c小鼠后，體內(nèi)CysLTs含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且CysLTs含量最低時也顯著高于正常對照組；同時，在各級支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)的CysLTs-R蛋白也呈現(xiàn)相似的先升高后降低的波動過程。說明體內(nèi)CysLTs含量與MP的感染具有相關(guān)性，這一結(jié)論為進(jìn)一步研究MP的感染機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］Okelo SO，Butz AM，Sharma R，et al.Interventions to modify health care provider adherence to asthma guidelines：a systematic review［J］.Pediatrics，2013，132（3）：517-534.

［2］Kim MH，Kang SY，Lee WI，et al.Comparison of two enzyme immunoassays for detecting mycoplasma pneumonia［J］.Lab Med，2012，43（4）：74-77.

［3］Jensen ME，Gibson PG，Collins CE，et al.Airway and systemic inflammation in obese children with asthma［J］.Eur Respir J，2013，42（4）：1012-1019.

［4］Pemira SM，Tolan RW.Mycoplasma pneumoniae infection presenting as bullous papular purpuric gloves and socks syndrome：novel association and review of the literature［J］.Clin Pediatr（Phila），2011，50（12）：1140-1143.

［5］Arkilo D，Pierce B，Ritter F，et al.Diverse seizure presentation of acute mycoplasma pneumoniae encephalitis resolving with immunotherapy［J］.J Child Neurol，2013，10（5）：1177-1180.

［6］Back M.Functional characteristics of cysteinyl-leukotriene receptor subtypes［J］.Life Sciences，2002，71（6）：611-622.

［7］張晗，尚云曉.支原體感染與支氣管哮喘［J］.國外醫(yī)學(xué)：兒科學(xué)分冊，2003，30（5）：236-239.

［8］Cho KJ，Seo JM，Shin Y，et al.Blockade of airway inflammation and hyperresponsiveness by inhibition of BLT2，a low-affinity leukotriene B4 receptor［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2010，42（3）：294-303.

［9］Pierse N，Arnold R，Keall M，et al.Modelling the effects of low indoor temperatures on the lung function of children with asthma［J］. J Epidemiol Community Health，2013，67（11）：918-925.

［10］Seo KY，Won DI，Cho MH，et al.Flow cytometric measurement of cold agglutinins for diagnosing mycoplasma pneumoniae pneumonia［J］.Lab Med，2012，43（12）：68-73.

［11］Blasi F，Johnston SL.The role of antibiotics in asthma［J］.Int J Antimicrob Agents，2007，29（5）：485-493.

［12］王莉，蔡栩栩，張晗，等.維生素D受體及cathelin相關(guān)抗菌肽在肺炎支原體感染小鼠肺組織中的動態(tài)表達(dá)及作用［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，42（10）：885-890

［13］Andrews KL，Jones SC，Mullan J，et al.Stigma：still an important issue for adults with asthma［J］.J Asthma Allergy Ed，2013，4（11）：165-171.

［14］Garcia G，Taillé C，Laveneziana P，et al.Anti-interleukin-5 therapy in severe asthma［J］.Eur Respir Rev，2013，22（5）：251-257.

（編輯武玉欣）

Influence ofMycoplasma Pneumonia Infection on the Expression ofLeukotriene and Its Receptor in BALB/c Mice

JIAOXu-yong1，ZHANGHan1，SHANGYun-xiao1，HE Meng-bo2，WANGLi1，WANG Gui-zhen2
（1.Department of Paediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Microbiology and Parasitology，Basic MedicalScience，China MedicalUniversity，Shenyang 110005，China）

ObjectiveTo investigate the expression of leukotriene and its receptor in BALB/c mice infected by mycoplasma pneumonia.MethodsA total of 100 BALB/c mice were randomly divided into mycoplasma pneumoniae（MP）infection group（MP group）and PBS control group（N group）（n=50）.Five mice were sacrificed from each group afterthe vaccination 3 d，7 d，14 d，21 d and 30 d，respectively，and lung tissue wascollected for harvest of alveolar perfusate（BALF）.CysLTs content was determined using ELISA kit；the rest of the lung tissue was fixed in formalin for sections，HE staining wasperformed forthe observation ofhistologicalchanges；CysLTs-Rexpression wasdetected by both immunohistochemicalassay and western blotanalysis.ResultsAs shown in histopathologicalobservation results，interstitialinflammatory changes occurred 3 d after MP infection，significantly increased on day 7，then gradually decreased after day 14，and was basically subsided on day 30；ELISA test results show that compared with normal group，MP CysLTs in BALF were significantly increased（P＜0.05），which peaked at day 7 and day 14 and then declined；immunohistochemistry analysis showed that CysLTs-R protein expression on the cell surface was enhanced in tracheal epithelial after MP infection；Western blotanalysis showed lung tissue CysLTs-Rprotein expression levels higherafterinfection atalltested time points than the Ngroup.Conclu?sionMPinfection can significantly increase the CysLTsand CysLTs-R expression in normalBALB/c mice.

mycoplasma pneumoniae；cysteinyl leukotriene；cysteinyl leukotriene receptor；BALB/c mouse

R725.6

A

0258-4646（2014）03-0226-05

遼寧省自然科學(xué)基金（2013021020）

焦旭勇（1986-），男，碩士研究生.

尚云曉，E-mail：shangyunx@sina.com

2013-11-04

網(wǎng)絡(luò)出版時間：