李帥帥，孫軍

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院錦州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧錦州121001；2.錦州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧錦州121002）

姜黃素對人肝癌細胞BEL?7402中環(huán)氧合酶?2表達影響的研究

李帥帥1，孫軍2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院錦州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧錦州121001；2.錦州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧錦州121002）

目的探討姜黃素對人肝癌細胞BEL-7402中環(huán)氧合酶2（COX-2）表達的影響。方法以不同濃度的姜黃素處理人肝癌細胞BEL-7402，CCK-8法分析細胞增殖，采用RT-PCR和Western blot方法檢測人肝癌細胞BEL-7402中COX-2的表達。以不同濃度的NS-398+10 μmol/L姜黃素處理人肝癌細胞BEL-7402，對照組單獨加入10 μmol/L姜黃素，RT-PCR和Western blot檢測VEGFmRNA、蛋白和HIF-1αmRNA、蛋白表達。結(jié)果不同劑量的姜黃素對肝癌細胞增殖率的影響與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；隨著姜黃素濃度的增加，COX-2mRNA表達逐漸降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；隨著姜黃素濃度的增加，COX-2蛋白表達逐漸降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/ L、NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組VEGFmRNA、VEGF蛋白、HIF-1α蛋白表達均降低，與姜黃素10 μmol/L組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L、NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組的HIF-1α mRNA表達與姜黃素10 μmol/L組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論姜黃素抑制人肝癌細胞BEL-7402中COX-2mRNA和蛋白的表達；姜黃素在人肝癌細胞BEL-7402中可能通過COX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF途徑抑制腫瘤血管生成。

姜黃素；肝腫瘤；環(huán)氧合酶2；血管內(nèi)皮生長因子；缺氧誘導(dǎo)因子-1α

我國是世界上原發(fā)性肝癌發(fā)病率最高的國家之一，且大多數(shù)病例在確診時肝功能儲備已很差，化療藥強烈的細胞毒性作用又進一步損害正常肝細胞，使肝臟功能進一步惡化。因此，對正常肝組織損傷小，抑癌作用強的抗癌藥物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用顯得尤為重要。姜黃素，姜科姜黃屬的多年生草本植物，美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥，具有靶向作用強，不良反應(yīng)小等優(yōu)點，同時具有明確的抑癌作用，這種作用是通過抑制腫瘤血管的新生來實現(xiàn)的［1］。目前認為，在腫瘤血管的生成過程中，環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2），一種前列腺素（prostaglandin，PG）E2合成限速酶，在肝癌中呈高表達狀態(tài)［2］，它能夠輔助產(chǎn)生PGE2從而刺激腫瘤的生長和血管新生。Bu等［3］針對原發(fā)性肝癌與COX-2之間的關(guān)聯(lián)做了Meta分析，結(jié)果顯示兩者之間存在極顯著的關(guān)聯(lián)性，而COX-2是血管生成的啟動子，如果能阻滯其啟動，就能有效控制腫瘤，因此，探討姜黃素對肝癌細胞中COX-2表達的影響，使其抗肝癌血管形成機制逐漸明確，成為新的研究熱點。實驗采用RT-PCR及Western blot方法，觀察姜黃素對人肝癌細胞株BEL-7402中COX-2表達的影響機制，從分子水平探討姜黃素抗腫瘤血管形成的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

姜黃素為Sigma公司產(chǎn)品，溶于少量DMSO中，加雙蒸水配制成500 μmol/L的水溶液，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO終濃度小于0.1%。特異性的COX-2抑制劑NS-398為碧云天公司產(chǎn)品，溶于少量DMSO中，配制成1 000 μmol/L的溶液，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，DMSO終濃度小于0.1%。RT-PCR試劑盒為碧波公司產(chǎn)品，引物由大連寶生物工程有限公司合成。兔抗人COX-2、VEGF、HIF-1α單克隆抗體（IgG），GAPDH單抗GAPDH單抗為Enogene公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理：人肝癌細胞BEL-7402由江陰康眾康民生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供。肝癌細胞BEL-7402中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，內(nèi)含100 U/L青、鏈霉素，在37℃、5%CO2、正常氧濃度飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代細胞，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。細胞進入對數(shù)生長期后，將細胞按2×105/mL密度接種于6孔板，24 h細胞貼壁后，分別加入不同濃度的姜黃素，使姜黃素的終濃度分別為0、2.5、5、10、15、20 μmol/L，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，收集細胞。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖：將人肝癌細胞BEL-7402按1×104/mL密度，每孔100 μL接種于96孔板，37℃、5%CO2孵育24 h，然后加入不同濃度姜黃素，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值（A）。

1.2.3 Western blot法：每孔細胞加入200 μL細胞裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為一致。制備10%SDS-page凝膠，每孔加入蛋白樣品20 μg電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，5%脫脂奶粉TBS緩沖液封閉，加入兔抗人COX-2、VEGF、HIF-1α單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體，4℃過夜，洗膜30 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育，在新鮮配制的NBT/BCIP底物溶液中顯色20 min，流水沖洗終止顯色，照相。內(nèi)參采用GAPDH。采用Fluorch-em 2.01軟件分析蛋白條帶積分A值（IDV）。以目的條帶與內(nèi)參條帶的比值代表目的蛋白的表達水平。試驗重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR提取細胞總RNA：加入Trizol提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，OD260/OD280=1.6～2.0。取5 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。2 μL cDNA用于PCR擴增。COX-2：上游引物5′-TCAAATGAGATTGTGGGAAAATTG-3′，下游引物5′-TCTAGTAGAGACGGACTCATAGAA-3′，擴增長度為310bp［2］；VEGF：上游引物5′-GGGCTGCTGCAATGACGA-3′，下游引物5′-GTTTAACTCAAGCTGCCTCGC-3′，擴增長度為360 bp；HIF-1α：上游引物5′-CAAAACACACAGCGAAG C-3′，下游引物5′-TCAACCCAGACATATCCACC-3′，擴增長度為473 bp；β-actin：上游引物5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′，下游引物5′-GCATAGCACAGCCTGGATAG-3′，擴增長度250 bp。PCR反應(yīng)：COX-2：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃最終延伸10 min。VEGF：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃最終延伸10 min；HIF-1α：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃最終延伸10 min；β-actin：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃最終延伸10 min。繼之1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，應(yīng)用Fluorchem 2.01軟件進行分析，PCR產(chǎn)物cDNA條帶與內(nèi)參條帶的吸光度值比值（A/A0）作為基因的相對表達量。試驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS17.0軟件完成，Western blot和RT-PCR結(jié)果為計量資料，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖分析

不同劑量的姜黃素（2.5、5、10、15、20 μmol/L）處理的人肝癌細胞BEL-7402，細胞增殖率分別為（6.23±0.74）%、（92.81±0.36）%、（89.38±0.36）%、（85.13±0.51）%、（79.32±0.49）%，與對照組（姜黃素0 μmol/L）（98.94±0.57）%相比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 不同劑量的姜黃素對人肝癌細胞BEL-7402中COX-2mRNA的影響

2.5 、5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理BEL-7402 6 h后，COX-2mRNA表達與對照組（2.40±0.05）相比分別降低至1.57±0.02、0.97±0.03、0.75±0.02、0.41± 0.03、0.17±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），RTPCR結(jié)果見圖1。

圖1 PCR檢測姜黃素對人肝癌細胞中COX?2mRNA的影響Fig.1 Effects of curcumin on mRNA expression of COX?2in human hepatocellular carcinoma cells by RT?PCR

2.3 不同劑量的姜黃素對人肝癌細胞BEL-7402中COX-2蛋白的影響

2.5 、5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理BEL-7402 6 h后，COX-2蛋白表達與對照組（3.30±0.14）相比分別降低至2.40±0.06、1.60±0.07、1.03±0.04、0.70± 0.06、0.33±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Western blot結(jié)果見圖2。

2.4 COX-2在姜黃素對肝癌細胞中VEGF、HIF-1α表達的作用

2.4.1 COX-2在姜黃素對肝癌細胞中VEGFmRNA表達作用：NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L、NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組VEGFmRNA表達與姜黃素10 μmol/L組（0.82±0.02）相比分別降低至0.50±0.01、0.31±0.02，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），RT-PCR結(jié)果見圖3。

2.4.2 COX-2在姜黃素對肝癌細胞中VEGF蛋白表達的作用：NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L、 NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組VEGF蛋白表達與姜黃素10 μmol/L組（0.85±0.03）相比分別降低至0.61±0.05、0.32±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Western blot結(jié)果見圖4。

圖2 WB檢測姜黃素對人肝癌細胞中COX?2蛋白的影響Fig.2 Effects of curcumin on protein expression of COX?2 in human hepatocellular carcinoma cells by WB

圖3 RT?PCR檢測VEGF mRNA表達Fig.3 The expression of VEGF mRNA used RT?PCR

圖4 Western blot檢測VEGF蛋白表達Fig.4 The protein expression of VEGF detected by Western blot

2.4.3 COX-2在姜黃素對肝癌細胞中HIF-1αmRNA表達的作用：NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L、NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組的HIF-1αmRNA表達分別為1.48±0.01、1.46± 0.03，與姜黃素10 μmol/L組（1.49±0.03）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），RT-PCR結(jié)果見圖5。

2.4.4 COX-2在姜黃素對肝癌細胞中HIF-1α蛋白表達中的作用：NS-398 100 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L、NS-398 200 μmol/L組+姜黃素10 μmol/L組HIF-1α蛋白表達與姜黃素10 μmol/L組（1.03±0.03）相比分別降低至0.63±0.01、0.29±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Western blot結(jié)果見圖6。

圖5 RT?PCR檢測HIF?1αmRNA表達Fig.5 The expression of HIF?1αmRNA by RT?PCR analysis

圖6 RT?PCR檢測HIF?1α蛋白表達Fig.6 The expression of HIF?1α protein determined by Western blot

3 討論

姜黃是姜科姜黃屬的多年生草本植物，姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，是咖喱、芥末中的主要黃色色素。姜黃素具有明確的抗腫瘤作用，它可以通過調(diào)節(jié)細胞周期中直接和間接結(jié)合的分子靶點來達到抑制腫瘤血管生成的作用［4，5］，而對于正常細胞和組織是安全的。姜黃素已經(jīng)被證明能夠影響各種各樣的與致癌作用相關(guān)的細胞因子，其中就包括COX-2［6］，COX-2是花生四烯酸生物合成前列腺素的限速酶，在大多數(shù)正常組織不表達，但在多種癌組織中，各種腫瘤促進因素的作用下呈誘導(dǎo)性表達，在腫瘤發(fā)病中起重要作用。既往研究表明，COX-2可能通過促進前列腺素的合成、促進血管形成、增加腫瘤細胞的侵襲力等參與腫瘤的形成，其中促進血管生成是其促癌作用的關(guān)鍵因素。依賴于新生血管的支持作用，腫瘤不斷地吸取營養(yǎng)而無限制地生長，同時又可通過不健全的血管進入血液循環(huán)，直至遠處擴散和轉(zhuǎn)移［7，8］。

在腫瘤血管生成的微環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是兩個不可或缺的關(guān)鍵因子，HIF-1在缺氧誘導(dǎo)的哺乳動物細胞中廣泛表達，為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，在存在COX-2表達的細胞中，特異的COX-2抑制劑NS-398通過抑制一種COX-2依賴的方式抑制HIF-1α的表達和功能，達到抑制缺氧誘導(dǎo)的血管生成的目的，而在無COX-2表達的細胞，NS-398對HIF-1α的作用就消失［9，10］，即COX-2/PGE2可以調(diào)控HIF-1α的表達。在腫瘤生長的微環(huán)境中，HIF-1α作為VEGF的調(diào)控因子而存在［11，12］。目前研究認為，在腫瘤組織的缺氧狀態(tài)下，高表達的HIF-1α促進VEGF的生成。VEGF作為一個最主要的細胞因子，在腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的過程中，特別是在腫瘤體積快速增長階段，VEGF的合成呈數(shù)倍增加，腫瘤細胞促血管生成能力大幅提高，與此同時，結(jié)構(gòu)和功能異常的血管開始出現(xiàn)并且逐漸增多，使癌細胞更容易通過異常的血管發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移［13～15］。綜上所述，COX-2、HIF-1α和VEGF在腫瘤新生血管的形成過程中均有不同程度的作用，他們之間存在著必然的聯(lián)系，并且在血管新生過程中很可能存在COX-2/ PGE2/HIF-1α/VEGF這樣一條途徑。

該研究表明，姜黃素可能通過抑制人肝癌細胞BEL-7402中COX-2mRNA和蛋白的表達來抑制肝細胞腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移，通過切斷腫瘤組織的營養(yǎng)來源影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸。同時，在肝細胞腫瘤中，特異性地抑制COX-2的表達，VEGF和HIF-1α的表達也隨之降低，表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用，提示姜黃素可能通過COX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF途徑抑制腫瘤的血管新生，而且對HIF-1α的這種抑制作用是通過轉(zhuǎn)錄后機制來實現(xiàn)的。

近年來，通過抑制血管生成來達到抗腫瘤目的已成為腫瘤治療的新熱點，姜黃素作為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥，具有不良反應(yīng)小，靶向作用強等優(yōu)點，具有良好的開發(fā)價值和應(yīng)用前景，值得我們進一步研究。

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（編輯裘孝琦）

EffectsofCurcumin on the Expression ofCyclooxygenase-2 in Human Hepatocellular Carcinoma BEL-7402 Cells

LIShuai-shuai1，SUNJun2
（1.Department of Digestive Disease，The Five Affiliated Hospital，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Department of Digestive Disease，Jinzhou CentralHospital，Jinzhou 121002，China）

ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on the expression of COX-2 in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells.MethodsHuman hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells were treated with various concentrations of curcumin.The cell proliferation was determined by CCK-8 method.The expressions of COX-2 in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells were detected by RT-PCR and Western blot.Human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells were treatment with different concentrations of NS-398 plus 10 μmol/L of curcumin or alone treated with 10 μmol/L of curcumin in control group，the mRNA and protein expression of VEGF and HIF-1α were checked by RT-PCR and Western blot.ResultsThe cell proliferation rate were significantly different between control and different concentrations of curcumin（P＜0.01）.Curcumin can down-regulate the expression ofCOX-2mRNA in a concentration dependent manner，and the differences were significant compared with the control（P＜0.01）；Curcumin can down-regulate the expression ofCOX-2 protein with the increase ofconcentration gradually and the differences were significant compared with the control（P＜0.01）.The expressions ofVEGFmRNA，VEGF protein，HIF-1α protein in 100 μmol/L of NS-398 plus 10 μmol/L of curcumin group，200 μmol/L of NS-398 plus 10 μmol/L of curcumin group were respectively reduced，and the differences were significant compared with the control（P＜0.01）；there was no significant difference of theHIF-1αmRNA expressions in 100 μmol/L of NS-398 plus 10 μmol/L of curcumin group，200 μmol/L of NS-398 plus 10 μmol/L of curcumin group comparing with the control（P＞0.05）.Conclu?sionThere is an inhibitory effectofcurcumin on the mRNA and protein expression ofCOX-2 in human hepatocellularcarcinoma BEL-7402 cells；Curcumin inhibits tumorangiogenesis in human hepatocellularcarcinoma BEL-7402 cells may through the pathway ofCOX-2/PGE2/HIF-1α/VEGF.

curcumin；liver cancer；cyclooxygenase-2；vascular endothelial growth factor；hypoxia-inducible factor-1α

RRRR

A

0258-4646（2014）03-0222-04

遼寧省自然科學(xué)基金（20112077）

李帥帥（1987-），女，住院醫(yī)師，碩士研究生. E-mail：381724012@qq.com

2013-11-24

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