賈愛慶，崔俊帥，董文武，王志宏，賀亮，張大林，呂承洲，張浩

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，甲狀腺外科，沈陽110001；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普通外科，遼寧大連116023）

HSP90和Sufu在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及意義

賈愛慶1，崔俊帥2，董文武1，王志宏1，賀亮1，張大林1，呂承洲1，張浩1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室，甲狀腺外科，沈陽110001；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普通外科，遼寧大連116023）

目的通過檢測熱休克蛋白90（HSP90）及Hedgehog信號通路關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子Sufu在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）組織中的表達(dá)情況，探討其與臨床病理特征的關(guān)系及意義。方法應(yīng)用Elivision兩步法免疫組化檢測152例PTC原發(fā)灶及其癌旁組織中HSP90和Sufu的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果HSP90和Sufu主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。HSP90在PTC組織中的陽性表達(dá)率為79.6%，明顯高于癌旁組織（64.5%，P＜0.01）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC中HSP90的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（86.7%和69.4%，P＜0.01）。Sufu在PTC組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織（41.4%和78.3%，P＜0.01）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC中Sufu的陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（30.0%和58.1%，P＜0.01）。HSP90與Sufu在PTC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.169，P=0.019）。結(jié)論HSP90和Sufu可能通過Hedgehog通路參與PTC的發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

甲狀腺乳頭狀癌；熱休克蛋白90；Hedgehog

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是21世紀(jì)全球范圍內(nèi)發(fā)病率增長最快的實體惡性腫瘤。熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）與腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤免疫和腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤學(xué)和免疫學(xué)研究的熱點，有研究表明，HSP90在PTC中的表達(dá)異常增高，并且HSP90特異性抑制劑geldanamycin能夠明顯抑制PTC細(xì)胞的增殖和侵襲力［1，2］。然而，HSP90在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)有研究表明，HSP90可激活前列腺癌細(xì)胞中Hedgehog（Hh）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且活化的Hh信號能夠促進(jìn)PTC細(xì)胞的增殖［3，4］。本研究通過檢測HSP90和Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused抑制物（Sufu）在PTC中的表達(dá)情況，進(jìn)一步了解它們在PTC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗標(biāo)本與試劑

1.1.1 臨床資料：選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科2008年3月至2011年4月術(shù)后病理確診為PTC的患者152例，獲取其每例標(biāo)本包括癌組織和癌旁組織（距腫瘤1 cm遠(yuǎn)，并經(jīng)病理證實的非癌組織），石蠟包埋病理組織標(biāo)本。其中男40例，女112例，男女比例1∶2.8；年齡7～82歲，中位年齡44歲；依據(jù)2010年AJCC［5］腫瘤分期：Ⅰ期91例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者90例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者62例；有周圍組織侵襲的患者53例，無侵襲的患者99例。

1.1.2 主要試劑：鼠抗人HSP90單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人Sufu單克隆抗體購自美國Abcam公司，ElivisionTMplus兩步法免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)：取石蠟包埋組織切片，脫蠟，水化，高壓抗原修復(fù)5 min，用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入一抗（HSP90為1∶400稀釋，Sufu為1∶200稀釋），4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，根據(jù)ElivisionTMplus兩步法［6］免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行操作，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，PBS返藍(lán)，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。用已知陽性的前列腺癌組織片作為陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：HSP90及Sufu蛋白的表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色至棕褐色顆粒為染色陽性。確定陽性標(biāo)準(zhǔn)：在高倍鏡下（400倍）對每張切片隨機(jī)選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，共計500個。著色強(qiáng)度：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，＞5%～≤25%為1分，＞25%～≤50%為2分，＞50%～≤75%為3分，＞75%為4分；兩者積分的乘積作為染色結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn)，并取5個高倍視野的平均值，得到范圍是0～12的分?jǐn)?shù)，按分?jǐn)?shù)分為4個等級：0～1分為（-）、2～4分為（+）、5～8分為（++）、9～12分為（+++），≥2分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，采用χ2檢驗進(jìn)行分析，兩者的相關(guān)性采用Spearmann秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSP90和Sufu在PTC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

圖1 HSP90在PTC組織和癌旁組織中的表達(dá)ElivisionTMplus×400Fig.1 Expression of HSP90 in PTC and paracancerous tissue ElivisionTMplus×400

圖2 Sufu在PTC組織和癌旁組織的表達(dá)ElivisionTMplus×400Fig.2 Expression of Sufu in PTC and paracancerous tissue ElivisionTMplus×400

HSP90及Sufu主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，見圖1、2。如表1所示，HSP90在PTC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），Sufu在PTC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 HSP90和Sufu表達(dá)與PTC臨床病理特征的關(guān)系（表2）

HSP90在PTC中的高表達(dá)以及Sufu的低表達(dá)與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期以及是否侵犯周圍組織無關(guān)。

2.3 PTC組織中HSP90與Sufu表達(dá)的相關(guān)性分析

HSP90和Sufu在PTC中的表達(dá)經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.169，P= 0.019）。

表1 HSP90和Sufu在PTC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況Tab.1 Expression of HSP90/Sufu between PTC tissues and paracancerous tissues

表2 PTC組織中HSP90和Sufu蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 The relationship between HSP90 and Sufu expression and clinicopathologic parameters of PTC

3 討論

HSP90是一類細(xì)胞含量豐富、高度保守的分子伴侶，對于眾多底物蛋白的穩(wěn)定和功能十分重要。目前的研究顯示，經(jīng)HSP90作用的底物蛋白有100多種，其多數(shù)可參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期和翻譯調(diào)控等過程。HSP90通過其分子伴侶作用與其客戶蛋白結(jié)合，形成分子伴侶復(fù)合物，穩(wěn)定客戶蛋白構(gòu)象，使其以活性形式存在，防止泛素化途徑降解，從而維持腫瘤細(xì)胞的生長優(yōu)勢，HSP90在乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、白血病等表達(dá)異常增高并且與腫瘤的惡性程度關(guān)系密切［7］。Mo等［1］研究發(fā)現(xiàn)，HSP90在PTC細(xì)胞系中的表達(dá)也明顯增高，并且通過作用于其客戶蛋白HIF-1α，促進(jìn)PTC的發(fā)生發(fā)展。孫春婷等［8］研究發(fā)現(xiàn)HSP90α在PTC中表達(dá)較甲狀腺腺瘤和正常甲狀腺明顯增高，并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與年齡、性別無關(guān)。HSP90特異性抑制劑（如geldanamycin、17-AAG）可以通過與HSP90的N末端ATP位點特異結(jié)合，抑制內(nèi)源性ATP酶活性，導(dǎo)致HSP90客戶蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解，從而通過阻斷多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［2，9］。本研究中，HSP90的陽性表達(dá)率為79.6%，明顯高于癌旁組織（64.5%），與Mo等［1］的研究一致。并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期以及是否侵犯周圍組織無關(guān)，可能是因為多數(shù)PTC分化程度較高，與其他惡性腫瘤相比惡性程度較低。

Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與正常的胚胎發(fā)育過程以及組織的創(chuàng)傷與修復(fù)，其持續(xù)的異?；罨c人類多種腫瘤（如口腔鱗癌、基底細(xì)胞癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和消化道腫瘤等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10～13］。Xu等［4］研究表明，而異?；罨腍h信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在PTC發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。SuFu作為Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的負(fù)性調(diào)控因子，可通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Gli，抑制Gli與下游靶基因的親和力，從而起到抑制Hh通路的作用［14］。Yue等［15］發(fā)現(xiàn)，激活的Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以促進(jìn)Sufu泛素化，然后使其在蛋白酶體中迅速降解。本研究中，Sufu在PTC組織中的陽性表達(dá)率為41.4%，明顯低于癌旁組織（78.3%），并且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。可能是由于Sufu基因突變，使其抑制Gli的能力減弱，則Gli與下游靶基因的親和力增強(qiáng)，促進(jìn)PTC的發(fā)生發(fā)展；也有可能是已經(jīng)激活的Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)使Sufu降解，這樣則使Sufu對Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控能力下降，對PTC的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

Kise等［3］在前列腺癌細(xì)胞系PC3中發(fā)現(xiàn)，HSP90可以穩(wěn)定Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused（Fu），特異性抑制HSP90能夠?qū)е翭u蛋白快速降解，表明HSP90存在于Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的胞質(zhì)蛋白復(fù)合體中，并參與對Fu蛋白的調(diào)控。本研究提示HSP90與Sufu在PTC組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有可能是HSP90通過作用于Fu蛋白，進(jìn)而激活Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活的Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解Sufu所致，然而兩者之間是否存在相關(guān)，尚有待進(jìn)一步的研究來證實。

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（編輯武玉欣）

Expression ofHSP90 and Sufu in Papillary Thyroid Carcinoma and Its ClinicalSignificance

JIA Ai-qing1，CUI Jun-shuai2，DONG Wen-wu1，WANG Zhi-hong1，HE Liang1，ZHANG Da-lin1，Lü Cheng-zhou1，ZHANG Hao1
（1.Unit of Thyroid Surgery，Department of General Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of General Surgery，The Third Hospital，Dalian MedicalUniversity，Dalian 116023，China）

ObjectiveTo investigate the expression ofHSP90 and Hedgehog signaling molecular Sufu in papillary thyroid carcinoma（PTC）and to explore the relationship between the HSP90，Sufu expression and clinicopathological parameters.MethodsThe expression of HSP90 and Sufu was examined in 152 cases of PTC tissues and paracancerous tissues using ElivisionTMplus.The relationship between the HSP90，Sufu expression and clinicopathologic parameters of PTC patients was analyzed.ResultsBoth HSP90 and Sufu expressed in cytoplasm.The positive rate of HSP90 expression in PTC tissues was 79.6%，which was significantly higher than the rate in paracancerous tissues（64.5%，P＜0.01）.The positive rate of HSP90 expression in the group with lymph node metastases was higher than in the group without lymph node metastases（86.7%vs 69.4%，P＜0.01）.The positive rate of Sufu expression in PTC tissues was significantly lower than the positive rate in paracancerous tissues（41.4%vs 78.3%，P＜0.01）.The positive rate of Sufu expression in the group with lymph node metastases was lower than in the group without lymph node metastases（30.0%vs 58.1%，P＜0.01）.In PTC tissues，HSP90 expression was negatively correlated with Sufu expression（r=-0.169，P=0.019）.Conclu?sionHSP90 and Sufu mightplay a role in the occurrence and lymph node metastasisofPTC though Hedgehog signaling pathway.

papillary thyroid carcinoma；HSP90；Hedgehog

R736.1

A

0258-4646（2014）03-0231-04

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2012225087）

賈愛慶（1987-），男，助教，碩士.

張浩，E-mail：haozhang@mail.cmu.edu.cn

2013-12-16

網(wǎng)絡(luò)出版時間：