鄭 飛 駱新榮 賈發(fā)青 高慶華， 韓春梅，*

(1 塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

前言

性控凍精的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展，特別是奶牛業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了重大而深遠(yuǎn)的影響。隨著性控凍精生產(chǎn)技術(shù)的日漸成熟，性控凍精也逐步向茸鹿、奶山羊等限性性狀家畜廣泛推廣。在未來的現(xiàn)代化畜牧業(yè)，性控凍精將有可能替代常規(guī)凍精，使家畜品種改良，品系化雜交繁育進(jìn)入一個(gè)全新的時(shí)代。

在性控凍精在制作過程中，精液的處理會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生各種影響，從而造成精子DNA的較大程度損傷[1，2]，由于受精時(shí)不完全依賴于精子DNA完整性，即便是DNA受損的精子仍可保持受精潛能，產(chǎn)生表型健康的性控后代，但性控凍精DNA損傷會(huì)對(duì)后代的遺傳穩(wěn)定性的產(chǎn)生遠(yuǎn)期影響，即使受精后損傷的DNA有一定的自修復(fù)能力[1]。因此，性控凍精的生物安全性應(yīng)被關(guān)注。

TUNEL法(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法)是檢測(cè)細(xì)胞凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA完整性的有效方法。單細(xì)胞凝膠電泳(single single-cell gel electropherosis,SCGE)又稱彗星法，是一種比較靈敏簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA損傷程度的方法。本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法和SCGE法分別對(duì)性控凍精DNA的完整性進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩種方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)性控凍精DNA的損傷程度的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

X/Y種畜(天津)有限公司生產(chǎn)規(guī)格為0.25 mL的性控奶牛細(xì)管凍精，種公牛號(hào)分別為12200145、12200171、12200176，精子數(shù)約230萬，活率40～45%。三頭公牛常規(guī)凍精每管精子數(shù)2 000萬，活率35～40% 。

1.2 試劑

TUNEL試劑盒購(gòu)自羅氏公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖，十二烷基肌氨酸鈉，蛋白酶K，DAPI購(gòu)自Promege公司，其它試劑購(gòu)自南京化學(xué)試劑公司。DYY-6B型電泳儀為北京六一儀器廠，TS100-F型熒光顯微鏡產(chǎn)自日本。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL法

嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，DAPI染色后在藍(lán)色背景下觀察。若為藍(lán)色，則為陰性，DNA無損傷；若有綠色熒光，則為陽性，DNA受損。采用雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)觀察100個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣本重復(fù)5次，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。

1.3.2 SCGE法

采用實(shí)驗(yàn)室已建立的SCGE法[3]，將精子密度調(diào)至2×106個(gè)/ ml左右，與1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻，鋪于被常熔點(diǎn)瓊脂糖包被的載玻片上，4 ℃裂解1.5 h，加入預(yù)冷的DTT 4 ℃作用1 h后，用含有蛋白酶K的細(xì)胞緩沖液消化過夜。4 ℃，15 V，150 mA電泳30 min，加入Tris-HCl，4 ℃中和2次，每次10 min。-20 ℃預(yù)冷的無水乙醇作用10 min后，吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察，觀察到彗星形狀為陽性，反之為陰性。采用雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)觀察50個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣本重復(fù)5次，取平均值作為檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)性控凍精和常規(guī)凍精的DNA損傷率進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

由表1可知TUNEL法檢測(cè)所得性控凍精DNA損傷陽性率高出常規(guī)凍精約32個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著。SCGE法對(duì)性控凍精DNA損傷的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)于常規(guī)凍精比較高出約31個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著。故性控凍精的DNA損傷程度極顯著高于常規(guī)凍精。

表1 TUNEL法與SCGE法對(duì)性控凍精DNA損傷的檢測(cè)

A常規(guī)凍精

B性控凍精

A常規(guī)凍精

B性控凍精

3 討論

3.1 DNA損傷檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)成功的用TUNEL法和SCGE法檢測(cè)了性控凍精DNA的損傷程度，結(jié)果與常規(guī)凍精相比均出現(xiàn)了差異極顯著的陽性率，說明精子核DNA受到損傷。結(jié)果與駱新榮等研究結(jié)果相符[3]。

相對(duì)于常規(guī)凍精，流式細(xì)胞儀分離得到的奶牛精子會(huì)受到更大程度的損傷，其功能和受精力也受到非常大的影響[4-5]。在使用流式細(xì)胞儀分選精子時(shí)，精子受到高度稀釋、高壓、電場(chǎng)等的影響[6-7]，尤其是核染色后，被激光照射會(huì)對(duì)精子DNA產(chǎn)生很大的損傷[8]。分選后的單性精子會(huì)處于極活躍狀態(tài)，其興奮性、運(yùn)動(dòng)力極強(qiáng)，故導(dǎo)致其存活時(shí)間相對(duì)較短。同時(shí)，在制作冷凍精液的過程中，精液的稀釋、離心、冷凍和保護(hù)劑的添加量等都能使精子DNA的完整性受到影響。趙宏遠(yuǎn)等研究發(fā)現(xiàn)冷凍后的山羊精子DNA損傷程度較新鮮精液的有明顯升高，差異極顯著[9]。劉奕等人研究發(fā)現(xiàn)染色對(duì)精子DNA的完整性有一定的影響，但與正常精子相比差異不顯著[10]。閆永健等人發(fā)現(xiàn)UVB照射對(duì)斑馬魚的早期胚胎發(fā)育有明顯影響，同時(shí)隨著照射時(shí)間的增加，胚胎對(duì)UVB的耐受力也增強(qiáng)[11]。雖然染色，激光照射等單個(gè)因素對(duì)精子的作用可能不明顯，但同時(shí)作用后精子的DNA損傷就會(huì)大幅提升。有研究表明細(xì)胞的自身修復(fù)能力很強(qiáng)[12-13]，不嚴(yán)重影響受精率、出生重等指標(biāo)，但我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)性控凍精的后代的初生重、受胎率等相對(duì)于常規(guī)凍精還是有所降低[14]。這可能與精子細(xì)胞受損傷的程度和自身修復(fù)能力有一定關(guān)系[1]。如果使用常規(guī)精液的冷凍程序(慢速降溫、中性稀釋液)，相當(dāng)數(shù)量的精子會(huì)在冷凍前死亡，故通過改變分選后精液的冷凍程序，有望提高凍后精子的活率，降低當(dāng)前每管凍精的精子數(shù)量，達(dá)到降低成本的目的。

3.2 TUNEL法和SCGE法對(duì)性控凍精DNA的損傷程度的評(píng)價(jià)

在人類男性不孕癥的研究中，很多運(yùn)用TUNEL法和SCGE法對(duì)精子DNA的完整性進(jìn)行檢驗(yàn)。Sergerie, M等比較了TUNEL法、SCSA法(精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 sperm chromatin structure assay)和SCGE法三種方法的檢測(cè)結(jié)果，認(rèn)為TUNEL法和SCGE法能更好的檢測(cè)出精子DNA單鏈及雙鏈的斷裂情況，而SCSA能檢測(cè)精子DNA在組裝壓縮過程發(fā)生的變化[4]。O'Flaherty C等分別用TUNEL法、SCSA法和SCGE法檢測(cè)睪丸癌和霍奇金淋巴瘤病人精子DNA的損傷情況，發(fā)現(xiàn)三種方法中SCGE法優(yōu)于前兩種，是檢測(cè)睪丸癌病人精子DNA組裝過程染色質(zhì)的變化情況最好一種方法[15]。

本實(shí)驗(yàn)用SCGE法檢測(cè)性控凍精DNA的損傷情況，結(jié)果與TUNEL法相似，說明SCGE法和TUNEL檢測(cè)均可作為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的有效方法。

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