曹淑超

(河南省氣象科學(xué)研究所，河南鄭州　450003)

0　引言

隨著生命科學(xué)的發(fā)展進(jìn)入分子水平，有人預(yù)言21世紀(jì)將是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的世紀(jì)，即從分子水平對疾病進(jìn)行診斷和治療。這就要求臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)準(zhǔn)確、快速、簡便、標(biāo)本微量化、方法標(biāo)準(zhǔn)化、且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。生物傳感器正是在此要求下出現(xiàn)的一類跨領(lǐng)域、多學(xué)科的前沿診斷儀器。國內(nèi)外對生物傳感器展開了廣泛深入地研究，已經(jīng)研制出了葡萄糖生物傳感器、乳糖生物傳感器、尿酸酶生物傳感器、DNA生物傳感器、BOD生物傳感器、測酚生物傳感器等多種類別的生物傳感器，來滿足人們在臨床檢驗(yàn)、氣象環(huán)境監(jiān)測和生化分析等領(lǐng)域中的需求[1-9]。

目前研制出的傳感器存在著各種各樣的弊端，難于從根本上提高其穩(wěn)定性、選擇性、靈敏度、準(zhǔn)確度和響應(yīng)速度等性能。因此，尋找新材料、新方法制備電流響應(yīng)值高生物傳感器，例如引入納米顆粒來增強(qiáng)傳感器的各項(xiàng)性能指標(biāo)是研究的重要方向[10-14]。

雞蛋膜厚約7 μm，含有約90%的蛋白質(zhì)，是半透性膜。用蛋膜制備酶電極是一種簡單、經(jīng)濟(jì)的方法，且因?yàn)槊肝粗苯油扛苍陔姌O上，電極更新方便；選用蛋膜來制備酶膜，為今后制備一次性酶試紙條提供了一個(gè)方向。

實(shí)驗(yàn)將納米二氧化硅凝膠和尿酸酶緊貼于蛋膜上，將酶膜緊貼于普魯士藍(lán)(PB)修飾的玻碳電極表面，然后以自制鉑片電極為對電極、甘汞電極為參比電極，組成三電極體系，制成尿酸酶生物傳感器。當(dāng)體液中的尿酸通過酶膜時(shí)，與酶進(jìn)行反應(yīng)，檢測出該處產(chǎn)生的反應(yīng)電流，然后將其換算成尿酸濃度加以顯示。應(yīng)用尿酸酶傳感器測定人體血和尿中尿酸的濃度，是一種準(zhǔn)確、快速、簡便的方法，可幫助診斷腎炎、白血病和腫瘤等疾病。

1　尿酸酶生物傳感器的工作原理

尿酸酶生物傳感器的工作原理是：尿酸在尿酸酶作用下，被分子氧氧化成尿囊素，并產(chǎn)生二氧化碳和過氧化氫。根據(jù)反應(yīng)前后氧的消耗，用電極監(jiān)測溶液中氧的變化，就可推算出尿酸的濃度，其工作機(jī)理如圖1所示。

圖1　尿酸在尿酸酶作用下的反應(yīng)機(jī)理

2　實(shí)驗(yàn)部分

2．1儀器與試劑

儀器：玻碳電極(天津蘭力天儀器有限公司)，鉑電極(自制，鉑片長×寬×厚為5 mm×4 mm×0．25 mm)，甘汞電極(上海雷磁)，CHI600型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

試劑：尿酸酶(4．6 units/mg，Sigma公司)，尿酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，牛血清白蛋白(BR)，戊二醛(CP)，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀(AR)，氯化鈉(AR)，正硅酸乙酯，雞蛋，氣透膜，改性納米二氧化硅(自制)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2．2尿酸酶電極的制備

取新鮮雞蛋殼小心剝離蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸餾水清洗；稱取12．5 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于250 μL 10 g/L尿酸酶溶液中；將蛋膜平鋪于潔凈的玻片上，小心裁取直徑為1 cm的圓形膜；在膜上依次滴加25 μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液、改性納米二氧化硅凝膠液、5 μL 2%戊二醛溶液，室溫放置3～4 h，置4 ℃冰箱冷藏過夜；過夜后的蛋膜用磷酸緩沖液(PBS)漂洗數(shù)次；將酶膜緊貼于PB修飾的玻碳電極表面，覆蓋氣透膜，即制成尿酸酶電極[15-16]。

實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。

圖2　納米顆粒增強(qiáng)的尿酸酶電極制作示意圖

2．3實(shí)驗(yàn)方法

采用三電極體系進(jìn)行檢測：制作的尿酸酶電極為工作電極，自制鉑片電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，底液為0．1 mol/L的KCl 磷酸鹽緩沖溶液，在一定的溫度下進(jìn)行檢測。測量時(shí)，先將三電極置于緩沖溶液中，加一電壓于工作電極(0.4 Vvs SCE)，當(dāng)背景電流值減小至一恒定值時(shí)，將電極放至被測尿酸溶液中，分別記錄不同時(shí)間的電流響應(yīng)值，扣除初始背景電流值，即為被測尿酸濃度的電極電流響應(yīng)值。

3　影響因素分析

3．1尿酸酶量的影響

電極上固定的酶量對傳感器的響應(yīng)有顯著影響。隨著酶固定量的增加，靈敏度增大，但線性范圍略有縮小。這是因?yàn)殡姌O上固定的酶量多時(shí)，催化尿酸反應(yīng)的速度就快，此時(shí)產(chǎn)生的過氧化氫不能及時(shí)在電極表面被還原，從而使線性范圍變窄。綜合考慮靈敏度、線性范圍及經(jīng)濟(jì)因素，最終選擇每支電極固定1．5 U的尿酸酶。

3．2尿酸濃度的影響

測量不同濃度尿酸的響應(yīng)信號，使得電極響應(yīng)與尿酸濃度呈良好的線性關(guān)系，酶電極在不同濃度的尿酸中的循環(huán)伏安如圖3所示。a為112．5 μg/mL；b為75 μg/mL；c為37．5 μg/mL；d為7．5 μg/mL；e為0 μg/mL確定尿酸酶生物傳感器檢測尿酸濃度的線性響應(yīng)范圍，如圖4 所示。實(shí)驗(yàn)測定尿酸濃度的線性響應(yīng)范圍為7．5～112．5 μg/mL．在pH 6．5的緩沖溶液中，對37．5 μg/mL的尿酸進(jìn)行平行測定11次，測得RSD為2．5%，表明重現(xiàn)性較好。

圖3　酶電極在不同濃度的尿酸中的循環(huán)伏安圖

圖4　尿酸濃度與響應(yīng)電流線性關(guān)系圖

3．3納米二氧化硅的影響

酶電極的性能是由酶的催化活性、酶活性中心和導(dǎo)電基質(zhì)之間電子交換速率決定的。納米顆粒比表面積大、表面自由能高，吸附能力較強(qiáng)，把納米顆粒引入到傳感器研究中，可以使更多的酶分子固定在納米顆粒表面。另外，由于納米顆粒尺寸很小，有可能與酶內(nèi)部的FAD親水基團(tuán)發(fā)生作用，從而引起酶構(gòu)型上的變化。這種變化使得酶的活性中心FAD更接近底物，提高了酶的催化效率。改性納米SiO2顆粒對生物分子具有很好的選擇吸附性，可望實(shí)現(xiàn)納米顆粒與酶分子活性中心及電極之間的直接電化學(xué)作用，增強(qiáng)生物傳感器的靈敏度。該實(shí)驗(yàn)對添加納米二氧化硅凝膠、添加改性的納米二氧化硅凝膠所制備的尿酸酶生物傳感器進(jìn)行了比較，如圖5所示。實(shí)驗(yàn)證明添加改性的納米二氧化硅有增強(qiáng)電流響應(yīng)信號的作用。

圖5　添加改性納米SiO2凝膠(a)與添加未改性納米的SiO2凝膠(b)的循環(huán)伏安圖

3．4緩沖溶液pH值的影響

緩沖溶液pH值對酶催化反應(yīng)速率和酶的活性有較大影響。尿酸酶最適宜pH范圍較寬。綜合考慮酶的活性以及響應(yīng)電流的最大的靈敏度，選擇最適宜的pH值為6．5。

3．5溫度的影響

溫度的變化將影響酶的活性及酶催化反應(yīng)速率。在10～35 ℃范圍內(nèi)考察氧化峰電流與溫度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)氧化峰電流隨溫度的升高而增大。考慮溫度較高時(shí)酶易變性失活，選擇最適宜的溫度25 ℃．

3．6工作電極的影響

將酶膜分別固定在鉑電極、玻碳電極、石墨電極上，觀察響應(yīng)電流的靈敏度，選擇最適宜的固定電極-玻碳電極進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3．7干擾試驗(yàn)

4　結(jié)束語

該方法研制的尿酸酶生物傳感器具有操作簡單、分析速度快、靈敏度高、所需試樣少的特點(diǎn)，通過進(jìn)一步研究后，有望應(yīng)用于臨床，幫助診斷腎炎、白血病和腫瘤等疾病。

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