齊 晶，周 賡，盧向陽(yáng)，田 云

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南長(zhǎng)沙410128）

漆酶（對(duì)苯二酚氧化酶，EC 1.10.3.2）是一類含銅的多酚氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶家族，能利用分子氧作為電子傳遞介質(zhì)氧化多種類型的酚類化合物及非酚類化合物，將分子氧還原為水［1－2］，是一種糖蛋白。漆酶因其底物范圍很寬而被廣泛應(yīng)用于紙漿漂白［3］、染料脫色［4］、有機(jī)物合成［5］、木質(zhì)素降解［6］等工業(yè)及生物技術(shù)領(lǐng)域。由于不同應(yīng)用領(lǐng)域要求不同酶學(xué)性質(zhì)的漆酶，因此通過(guò)開(kāi)發(fā)新的漆酶基因資源來(lái)獲得具有多樣性的漆酶意義重大。在自然界中存在著大量無(wú)法用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的微生物，科研工作者通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，從中篩選漆酶基因，為漆酶的多樣性、高效性篩選提供了新的途徑。

1 漆酶的作用特點(diǎn)及研究現(xiàn)狀

1.1 漆酶的催化氧化特性

漆酶含有4個(gè)銅離子，分別存在于3個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)上，在漆酶的催化機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用［7］。漆酶能夠利用氧氣作為電子受體，氧化多種酚類及芳香族化合物［8］。大部分漆酶以胞外單分子球蛋白的形式存在，分子質(zhì)量在40～110kDa之間，漆酶分子都存在著不同程度的糖基化［9］。

漆酶的催化氧化作用主要由漆酶的4個(gè)銅離子和底物的自由基共同完成。漆酶分子結(jié)構(gòu)中的4個(gè)銅離子構(gòu)成了2個(gè)活性中心：T1銅離子結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)與漆酶底物的氧化能力相關(guān)聯(lián)；T2和2個(gè)T3銅離子組成三銅離子還原中心結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)不僅能接收來(lái)自T1位點(diǎn)的電子，還能將氧氣還原成水。底物與酶活性中心的T1銅離子位點(diǎn)相結(jié)合，底物氧化釋放電子，三銅離子還原中心通過(guò)His－Cys－His途徑轉(zhuǎn)化電子，接著將電子傳遞給氧分子，將氧分子還原成水［10］。與此同時(shí)，漆酶底物形成自由基，底物的自由基自身可以結(jié)合也可以相互偶聯(lián)，從而生成聚合物或偶聯(lián)產(chǎn)物［11］。漆酶屬于單電子氧化還原酶類，在小分子介質(zhì)存在下，漆酶還能夠氧化非酶底物［12］。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，漆酶的催化底物已達(dá)200多種［13］，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的特異性分為6類：（1）酚類及其衍生物：鄰、對(duì)苯二酚等；（2）芳胺類及其衍生物：氨基苯、1，5－萘二胺；（3）羧酸及其衍生物：原兒茶酸、香豆酸、對(duì)氨基水楊酸；（4）甾體激素和生物色素：雌甾二醇、氧化膽紅素；（5）金屬有機(jī)化合物：二茂鐵類化合物；（6）其它非酚類化合物：亞鐵氰化鉀、抗壞血酸。

1.2 漆酶的研究現(xiàn)狀

漆酶作為一種生物酶，具有酶的所有特點(diǎn)，溫度、底物、pH值對(duì)漆酶的影響非常大。漆酶在生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中都有可能失活，影響酶的使用效果。漆酶按來(lái)源可以分為植物漆酶、真菌漆酶、細(xì)菌漆酶以及動(dòng)物漆酶等4大類［8］。表1列出了這4類酶的優(yōu)缺點(diǎn)［8，14－15］。

在這4類漆酶中，以真菌漆酶研究得最為深入。真菌漆酶的研究主要包括以下4方面：（1）對(duì)不同產(chǎn)漆酶真菌進(jìn)行菌種篩選、基因克隆，篩選出高效、產(chǎn)酶量大的菌種，其中白腐真菌產(chǎn)生的漆酶被認(rèn)為是效果最好的［16］，但真菌漆酶的一些缺點(diǎn)（如熱穩(wěn)定性差、不能用于原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)等）也限制了其應(yīng)用范圍；（2）對(duì)產(chǎn)漆酶真菌菌種進(jìn)行改造，包括利用物理、化學(xué)、生物等方法使菌株發(fā)生改變，提高漆酶產(chǎn)量，以及對(duì)真菌漆酶的分子結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的研究；（3）對(duì)產(chǎn)漆酶真菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使漆酶產(chǎn)量最大化；（4）真菌漆酶在降解木質(zhì)素方面的理論研究，以及在造紙、紡織工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

表1 4類漆酶的優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 The advantages and disadvantages of the four kinds of laccases

漆酶的催化底物較多，因此具有廣闊的應(yīng)用前景，但天然來(lái)源的4類漆酶存在產(chǎn)量低、性質(zhì)單一、價(jià)格昂貴、活性不穩(wěn)定等不足，難以滿足實(shí)際需求，漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)也受到影響。

2 未培養(yǎng)微生物中漆酶基因的研究進(jìn)展

2.1 未培養(yǎng)微生物及研究手段

未培養(yǎng)微生物（uncultured microorganisms）是指到目前為止人們還無(wú)法純培養(yǎng)的微生物［17］。環(huán)境中絕大部分的微生物還沒(méi)有被人類所認(rèn)識(shí)，其中勢(shì)必蘊(yùn)含著巨大的生物資源。無(wú)論是未培養(yǎng)微生物的種群結(jié)構(gòu)，還是其功能的特異性、新陳代謝途徑等都與純培養(yǎng)微生物有著不一樣的特點(diǎn)，這其中隱藏著大量未知的生物遺傳信息［18］。所以開(kāi)發(fā)和利用未培養(yǎng)微生物，并從特定的環(huán)境中篩選出某些未知的微生物、克隆獲得具有特異性功能的基因是目前微生物資源的研究熱點(diǎn)。

因?yàn)樽匀画h(huán)境中大部分的微生物不能依靠傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進(jìn)行篩選，造成了微生物資源的浪費(fèi)和丟失，為此科研工作者研發(fā)了一種新的方法——宏基因組學(xué)（metagenomics）［19］對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行研究。宏基因組的定義為：環(huán)境中全部微生物的遺傳物質(zhì)的總和，包括可培養(yǎng)的微生物基因和不可培養(yǎng)的微生物基因。宏基因組技術(shù)是：提取特定環(huán)境中的總DNA分子，克隆到大腸桿菌等宿主細(xì)胞中用來(lái)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)［20］，然后再對(duì)宏基因組文庫(kù)中的克隆子進(jìn)行功能驅(qū)動(dòng)篩選和序列驅(qū)動(dòng)篩選分析。目前，已經(jīng)通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)篩選得到大量新的基因，如編碼纖維素酶［21］、蛋白酶［22］、酯酶［23］、木聚糖酶［24］等活性物質(zhì)的基因。

2.2 未培養(yǎng)微生物中漆酶基因的研究進(jìn)展

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)逐漸朝著分子層面進(jìn)行，如漆酶的異源表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。漆酶異源表達(dá)是將獲得的漆酶基因插入適合的載體中進(jìn)行高效表達(dá)的分子技術(shù)。完成漆酶異源表達(dá)的前提是必須得到漆酶基因。在漆酶基因的克隆和鑒定方面，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外采用的主要方法是：首先從以木質(zhì)纖維素為食物的昆蟲(chóng)［25－26］或利用木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為自身生長(zhǎng)需要的菌類［27］等具有木質(zhì)素降解能力的環(huán)境中分離具有漆酶活性的微生物，接著對(duì)獲得的菌株進(jìn)行鑒定，利用分子生物學(xué)的方法對(duì)漆酶基因進(jìn)行克隆、鑒定和表達(dá)，研究菌株的產(chǎn)漆酶條件和漆酶的酶學(xué)特性。

目前，科研工作者從未培養(yǎng)微生物中篩選克隆新的漆酶基因［28］，并將新的漆酶基因構(gòu)建至表達(dá)載體，對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，豐富了漆酶性質(zhì)的多樣性。Beloqui等［26］從牛瘤胃中構(gòu)建宏基因組文庫(kù)篩選得到RF51基因，生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè)這些序列屬于擬桿菌屬，將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)得到的漆酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)、銅離子結(jié)合位點(diǎn)等的分析；Coy等［29］從白蟻后腸中篩選得到RfLacA、RfLacB基因，通過(guò)對(duì)其編碼的蛋白研究發(fā)現(xiàn)，白蟻后腸的漆酶來(lái)源于白蟻，在唾液腺產(chǎn)生，分泌到前腸，結(jié)合銅離子后，在白蟻腸道中對(duì)木質(zhì)纖維素的降解起作用；Ye等［30］從紅樹(shù)林環(huán)境中構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，篩選獲得一段大小為1 500bp的具有堿性漆酶活性的基因，命名為L(zhǎng)ac591，Lac591基因與嗜堿芽孢桿菌的漆酶相比同源性為52%，且有4個(gè)作為銅離子結(jié)合位點(diǎn)的組氨酸保守區(qū)域；Fang等［31－32］從中國(guó)南海的海洋微生物中通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)篩選獲得1個(gè)在弱堿性條件下有獨(dú)立活性且對(duì)氯化物有極強(qiáng)耐受性的新漆酶基因片段，命名為L(zhǎng)ac15，Lac15有439個(gè)氨基酸，大小為1 320bp，含有3個(gè)保守的Cu2＋結(jié)合區(qū)域；Fang等［33］從熊貓糞便中構(gòu)建宏基因組文庫(kù)篩選得到Lac51基因，該基因編碼的漆酶不僅是金屬離子的氧化酶，而且很有可能是在宿主細(xì)胞胞外起作用的胞外酶，因?yàn)長(zhǎng)ac51基因的N端有一個(gè)TAT型的信號(hào)肽。

在牛瘤胃、白蟻后腸、紅樹(shù)林土壤、南海海水、熊貓糞便等未培養(yǎng)微生物中克隆得到漆酶基因的具體研究 情況見(jiàn)表2。

表2 未培養(yǎng)微生物中漆酶基因的研究情況Tab.2 Research status on laccase genes from uncultured microorganisms

以上研究成果說(shuō)明，通過(guò)構(gòu)建未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫(kù)能克隆到新的高效漆酶基因，未培養(yǎng)微生物是一個(gè)巨大的資源庫(kù)，不僅數(shù)量多，而且種類豐富，為漆酶基因篩選的多樣性、高效性提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 展望

宏基因組技術(shù)避開(kāi)了需要培養(yǎng)的步驟，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)微生物技術(shù)的不足，為人們調(diào)查微生物的群落及其資源、開(kāi)發(fā)利用未培養(yǎng)微生物的多樣性、發(fā)現(xiàn)新的基因提供了很好的策略［34］。宏基因組技術(shù)是一種高效快速獲得漆酶基因的方法，豐富了漆酶的來(lái)源，拓寬了木質(zhì)素酶的研究領(lǐng)域，加強(qiáng)了未培養(yǎng)微生物中漆酶的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，在生物質(zhì)資源研究和綜合利用等方面具有重要的意義。

在篩選新型的工業(yè)用酶和生物活性物質(zhì)方面，宏基因組技術(shù)具有高效、快速等優(yōu)勢(shì)，在未培養(yǎng)微生物的尋找、功能基因篩選、生態(tài)學(xué)研究等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛能。

由于漆酶功能的特殊性，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)和完善以下兩方面工作：（1）目前對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選多采用底物丁香醛連氮及愈創(chuàng)木酚，但這兩種底物對(duì)漆酶反應(yīng)的效果不是很明顯［32］，因此，選擇更合適的篩選底物能夠大大提高篩選效率；（2）加強(qiáng)漆酶性質(zhì)與功能方面的研究：造紙工業(yè)，主要是利用漆酶對(duì)纖維素進(jìn)行降解，降解機(jī)理以及詳細(xì)的降解過(guò)程還有待進(jìn)一步研究［35］；紡織工業(yè)，排放的廢水大部分都是高溫且呈堿性的，要利用漆酶降解廢水中的染料［36］，必須加強(qiáng)漆酶的性質(zhì)以及漆酶的固定化等方面的研究。

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