姜雅秋，姜雷，郭新紅，王安邑，孫秋巖

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001；2.保健科，沈陽110122）

強迫游泳應(yīng)激對大鼠甲狀腺激素及垂體促甲狀腺激素β亞基表達水平的影響

姜雅秋1，姜雷2，郭新紅1，王安邑1，孫秋巖1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽110001；2.保健科，沈陽110122）

目的探討強迫游泳應(yīng)激對Wistar大鼠甲狀腺功能及垂體促甲狀腺激素（TSH）β亞基（TSHβ）蛋白和mRNA表達水平的影響。方法選擇6周齡Wistar雄性大鼠隨機分成5組，除對照組外，強迫游泳10 min后分別于10 min、2 h、12 h及24 h斷頭，取血，化學(xué)發(fā)光分析法測定各組大鼠血清TSH、游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和游離甲狀腺素（FT4）水平；留取各組Wistar大鼠垂體，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測TSHβ蛋白表達水平，垂體組織勻漿應(yīng)用實時定量PCR分析TSHβmRNA表達水平。結(jié)果強迫游泳后2 h組、12 h組和24 h組血清FT3、FT4均升高，較對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），10 min組、2 h組及24 h組血清TSH水平較對照組無明顯變化，但12 h組較其余各組均明顯升高（P＜0.05）。垂體TSHβ蛋白及mRNA表達強迫游泳后12 h組也較其他組明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論強迫游泳應(yīng)激可影響Wistar大鼠甲狀腺功能，使血中甲狀腺素水平升高。強迫游泳應(yīng)激后Wistar大鼠垂體TSHβ蛋白及mRNA表達水平增加，峰值出現(xiàn)在12 h。提示丘腦-垂體-甲狀腺軸可能在急性心理和生理應(yīng)激時同樣發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

游離三碘甲腺原氨酸；游離甲狀腺素；促甲狀腺激素；促甲狀腺激素β亞基

甲狀腺素不僅在細胞的代謝、氧消耗，組織的生長、成熟和分化以及人體脂肪、碳水化合物代謝調(diào)節(jié)等方面起重要作用［1］，下丘腦-垂體-甲狀腺軸（hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT）也構(gòu)成了人體應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)的重要一環(huán)［2，3］。隨著神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控及其機制研究的進展，應(yīng)激對機體的負面作用也越來越被人們重視，有研究發(fā)現(xiàn)心理應(yīng)激可明顯降低機體的免疫功能［4］。在引起機體各種急性應(yīng)激的突發(fā)重病發(fā)生時，血里的三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）往往會偏低（低T3綜合征）［5］；有學(xué)者通過對心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn)低T3血癥是其預(yù)后不良與死亡的獨立風(fēng)險因子［6］，而最近一些研究發(fā)現(xiàn)對難治抑郁癥進行抗抑郁藥物治療時若能加用T3則能使療效顯著增高［7］。目前關(guān)于應(yīng)激與甲狀腺激素水平的研究結(jié)果不一，一些使用輕微刺激（如心理應(yīng)激、慢束縛實驗等）的實驗發(fā)現(xiàn)外周血甲狀腺激素水平輕微增加或無明顯變化，一些使用較重程度刺激（如電擊刺激等）的實驗則發(fā)現(xiàn)外周血甲狀腺激素水平降低［3］，有學(xué)者認為這表現(xiàn)了HPT軸對應(yīng)激強度及密度的敏感性［8］。本研究通過分析強迫游泳應(yīng)激后外周血游離甲狀腺素（free thyroxin，F(xiàn)T4）、游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、垂體TSH β亞基（TSHβ）蛋白及其mRNA表達的變化，綜合探討急性應(yīng)激對HPT軸的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級Wistar雄性大鼠38只，體質(zhì)量250～280 g。實驗前自由飲食水，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗循環(huán)環(huán)境中。實驗前1周開始每天撫摸動物5 min，以使大鼠習(xí)慣實驗者。隨機分為5組，第1組（n=8）：對照組，當日斷頭，心臟取血；第2組～第5組：分別于26℃溫水中強迫游泳10 min后立即（n= 7）、2 h（n=7）、12 h（n=8）、24 h（n=8）斷頭取垂體，心臟取血。垂體組織快速冷凍，保存于-70℃?zhèn)溆?。血標本立即?℃、3 000 r/min離心取血漿，保存于-20℃?zhèn)溆谩嶒炘?：00～12：00內(nèi)進行。

1.2 方法

1.2.1 血中激素測定：血清FT3、FT4及TSH應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法測定。

1.2.2 垂體TSHβ冰凍切片免疫組化染色：從-70℃冰箱取出組織，4%的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定1 h；0.01 mol/L PBS洗；3%H2O2去離子水孵育10 min，0.01 mol/L PBS洗；滴加一抗（1∶100），37℃水浴箱孵育90 min；0.01 mol/L PBS洗；滴加試劑PV9003于4℃冰箱孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗；DAB顯色，自來水終止反應(yīng)后，蘇木素復(fù)染；返藍；封片；采用圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 5.1對冰凍切片染色結(jié)果進行定量檢測，檢測各組大鼠垂體陽性表達染色的平均光密度，以每組標本15個視野的累積光密度（IOD）的平均值作為該例的測量值。

1.2.3 垂體TSHβmRNA實時定量PCR：組織勻漿；兩相分離：12 000 r/m、4℃離心15 min，小心吸取上層水相至新的1.5 mL RNase Free的EP管中；上清液中加入200 μL-20℃預(yù)冷的氯仿，混勻，待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min；12 000 r/m、4℃離心20 min；吸取最上層透明水相至新的1.5 mL RNase Free的EP管中。RNA沉淀：向上述的水相中加入400 μL異丙醇，混勻，12 000 r/m、4℃離心10 min；RNA清洗：棄去上清，加入1 mL DEPC水配制的75%乙醇（已-20℃預(yù)冷），12 000 r/m、4℃離心5 min，棄上清，干燥；RNA融解：再加入20 μL DEPC水溶解。RNA的純度鑒定及含量測定：取RNA樣品2 μL加入198 μL DEPC水后，以紫外分光光度計測260 nm和280 nm OD值，計算OD260/OD280比值，若其值＞1.8，則視為提取的RNA純度可用。mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：Total RNA根據(jù)原始濃度稀釋為100 ng/μL，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit）的說明書將抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時PCR分析大鼠垂體組織中TSHβmRNA表達水平。設(shè)計引物根據(jù)美國NCBI數(shù)據(jù)庫基因序列信息，用引物設(shè)計軟件Primer 5.0分別設(shè)計出TSHβ和GAPDH基因的引物，由大連寶生物工程公司合成并純化。為保證實驗的標準化，在PCR反應(yīng)中同時擴增一內(nèi)源性參照基因。在TSHβ基因表達研究中，本研究選擇看家基因GAPDH為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后確認實時PCR的擴增曲線，并要求溶解曲線為單峰；標準曲線R2≥0.98；擴增效率E≥2.0之間；陰性對照無熒光信號；應(yīng)用LightCycler 480軟件選擇“Advanced Relative Quantitation”分析路徑對目的基因mRNA表達的差異進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理、分析，所有數(shù)據(jù)均采用表示，采用單因素方差分析與t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清FT3和FT4水平

強迫游泳應(yīng)激后2 h組、12 h組和24 h組血清FT3、FT4均較對照組有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 血清TSH水平

血清TSH水平10 min組、2 h組較對照組無明顯變化（P＞0.05），但12 h組TSH水平明顯升高，與對照組、10 min組及2 h組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但游泳應(yīng)激后24 h血清TSH水平與12 h相比明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），且24 h血清TSH水平基本恢復(fù)到應(yīng)激前水平（表1）。

2.3 垂體TSHβ表達水平

垂體TSHβ表達水平以IOD表示，10 min組與對照組比較無明顯變化，2 h組較對照組升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），12 h組較對照組、10 min組及2 h組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。24 h組較12 h組有所降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但較對照水平仍升高，未恢復(fù)到應(yīng)激前水平（表1，圖1）。

表1 強迫游泳應(yīng)激后血清FT3、FT4、TSH及垂體TSHβ表達水平的變化Tab.1 Change of serum FT3，F(xiàn)T4，TSH and pituitary TSHβ expression level after forced swimming stress

圖1 垂體TSHβ免疫組化染色×400Fig.1 Immunohistochemical staining of pituitary TSHβ×400

2.4 大鼠垂體TSHβmRNA表達水平

TSHβmRNA在大鼠垂體組織中的表達水平各實驗組較對照組升高，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），24 h組較12 h組有所降低，但較對照組水平仍升高，未恢復(fù)到應(yīng)激前水平。見圖2。

圖2 強迫游泳應(yīng)激后垂體TSHβmRNA表達水平的變化Fig.2 Dynamic change of pituitary TSH βmRNA expression level after forced swimming stress

3 討論

本研究探討強迫游泳應(yīng)激對HPT軸功能變化的影響，研究中發(fā)現(xiàn)強迫游泳應(yīng)激可使外周FT3、FT4及TSH增加，同時垂體TSH表達也增加。

有研究報道強迫游泳應(yīng)激可使HPT軸中糖皮質(zhì)激素的分泌于短期內(nèi)明顯增加并恢復(fù)正常，即強迫游泳應(yīng)激10 min后糖皮質(zhì)激素較前明顯增加，但2 h后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平［9］。我們應(yīng)用相同的應(yīng)激形式及強度處理大鼠來研究對HPT軸功能的影響，結(jié)果提示強迫游泳應(yīng)激對HPT軸的影響隨時間的動態(tài)變化是不同的，TSH的升高較促腎上腺皮質(zhì)激素的變化出現(xiàn)的慢而且持續(xù)時間較長，24 h后仍未恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。

一般認為，甲狀腺激素起作用時間在數(shù)日到數(shù)周內(nèi)，近來的研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素的短暫改變也可能造成一些明顯后果，如對大鼠腹膜內(nèi)注射T3能導(dǎo)致其海馬內(nèi)BDNFmRNA在2 h內(nèi)顯著變化［10］，皮下注射2 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)大鼠食量增加［11］，此外T3對海馬神經(jīng)活性變化的影響也被證實［12］。這些甲狀腺激素的急性作用可能通過基因調(diào)控的細胞膜受體而起作用，但也可能不通過此途徑起作用［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠在強迫游泳后12 h出現(xiàn)T3、T4以及TSH增高。學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)較輕的刺激（如心理、慢性束縛等）能引起大鼠血中甲狀腺激素水平升高，與本研究結(jié)果相似。我們利用實時定量PCR測定垂體TSHβmRNA表達水平和血中TSH水平趨勢略有不一致，可能由于合成與釋放不同步，或是部分來自其脈沖式釋放的特性。垂體TSHmRNA表達的增高再次證明了應(yīng)激對HPT軸產(chǎn)生的影響，解釋了TSH增高的一個可能來源，未來應(yīng)進一步探討游泳應(yīng)激對下丘腦室旁核促甲狀腺激素釋放激素的含量及表達的影響。

很多應(yīng)激源如寒冷、高熱都可以直接通過中樞溫度感受器直接作用于HPT，促甲狀腺激素釋放激素、TSH相繼釋放，使甲狀腺激素分泌增加。急性應(yīng)激可能主要通過藍斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)整合分析作出應(yīng)答，進而興奮交感神經(jīng)，加速腎上腺髓質(zhì)功能，使血漿中兒茶酚胺的濃度迅速升高，進而刺激甲狀腺激素分泌有關(guān)。多數(shù)認為長期應(yīng)激導(dǎo)致的甲狀腺激素，尤其是T3的降低與下丘腦-垂體-腎上腺軸密切相關(guān)。

游泳應(yīng)激對HPT軸功能影響的機制尚待進一步研究。在應(yīng)激的經(jīng)典模型中，皮質(zhì)醇激素會表現(xiàn)出顯著增高，有研究發(fā)現(xiàn)其能在垂體水平對TSH的釋放產(chǎn)生影響，但也有研究認為這個作用發(fā)生在下丘腦水平［14，15］。對腎上腺切除的動物重復(fù)這種應(yīng)激實驗可能可以進一步對此類機制作出解釋。

［1］Wrutniak-Cabello C，Casas F，Cabello G.Thyroid hormone action in mitochondria［J］.J Mol Endocrinol，2001，26（1）：67-77.

［2］Helmreich D，Crouch M，Dorr N，et al.Peripheral triiodothyronine（T3）levels during escapable and inescapable shock［J］.Physiol Behav，2006，87（1）：114-119.

［3］Kilburn-Watt E，Banati RB，Keay KA.Altered thyroid hormones and behavioural change in a sub-population of rat following chronic constriction injury［J］.J Neuroendocrinol，2010，22（8）：960-970.

［4］邵楓，林文娟，王瑋雯，等.心理應(yīng)激的免疫抑制作用及其神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)的相關(guān)性［J］.心理學(xué)報，2001，33（1）：43-47.

［5］Mebis L，Van den Berghe G.Thyroid axis function and dysfunction in critical illness［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011，25（5）：745-757.

［6］Iervasi G，Pingitore A，Landi P，et al.Low-T3syndrome：a strong prognostic predictor of death in patients with heart disease［J］.Circulation，2003，107（5）：708-713.

［7］Richard C，Shelton MD.The use of antidepressants in novel combination therapies［J］.J Clin Psychiatry，2003，64（Suppl 2）：14-18.

［8］Helmreich DL.Thyroid hormone regulation by stress and behavioral differences in adult male rats［J］.Horm Behav，2011，60（3）：284-291.

［9］Jiang YQ，Kawashima H，Uchida K，et al.Differential effects of forced swim-stress on the corticotrophin-releasing hormone and vasopressin gene transcription in the parvocellular division of the paraventricular nucleus of rat hypothalamus［J］.Neurosci Lett，2004，358（3）：201-204.

［10］Sui L，Ren WW，Li BM.Administration of thyroid hormone increases reelin and brain-derived neurotrophic factor expression in rat hippocampus in vivo［J］.Brain Res，2010，1313（8）：9-24.

［11］Kong WM，Martin NM，Smith KL，et al.Triiodothyronine stimulates food intake via the hypothalamic ventromedial nucleus independent of changes in energy expenditure［J］.Endocrinology，2004，145（11）：5252-5258.

［12］Caria MA，Dratman MB，Kow LM，et al.Thyroid hormone action：nongenomic modulation of neuronal excitability in the hippocampus［J］.J.Neuroendocrinol，2009，21（2）：98-107.

［13］Davis PJ，Leonard JL，Davis FB.Mechanisms of nongenomic actions of thyroid hormone［J］.Front Neuroendocrinol，2008，29（2）：211-218.

［14］Roelfsema F，Pereira AM，Biermasz NR，et al.Diminished and irregular TSH secretion with delayed acrophase in patients with Cushing′s syndrome［J］.Eur J Endocrinol，2009，161（5）：695-703.

［15］Haugen BR.Drugs that suppress TSH or cause central hypothyroidism［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2009，23（6）：793-800.

（編輯 陳姜）

EffectofForced Swimming Stresson Thyroxineand the Expression ofThyroid-stimulating Hormone βSubunitin Pituitary of Rat

JIANGYa-qiu1，JIANGLei2，GUOXin-hong1，WANGAn-yi1，SUNQiu-yan1
（1.Department of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Out-patient Department，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo clarify changes in the blood leveloftriiodothyronine（T3），thyroxin（T4），and expression levelofthyroid-stimulating hormone（TSH）β subunit（TSHβ）mRNA at pituitary in Wistar rats after forced swimming stress.MethodsMale Wistar rats with an age of 6 weeks were randomly divided into five groups（10 min，2 h，12 h，24 h，control group）depending on the time delayed after the 10-minute forced swimming.Blood was collected for serum TSH measurement by chemiluminescent immunoassay，pituitary tissue was excised for measurement of TSH expression by immunohistochemistry assay，pituitaries were also excised for extraction of total RNA.Real-time PCR was performed for quantification ofTSHβmRNA.ResultsSerum T4and T3in the 2 h，12 h and 24 h groups increased after forced swimming stress，but the increase was not significant as compared with that of the control group（P＞0.05）.Serum TSH of the 12 h group increased significantly compared with those of the other groups（P＜0.05），but no significant change were noticed between the 10 min，2 h，24 h groups and the control group.TSHβmRNA expression at pituitary showed similar results.ConclusionForced swimming stress influenced the function of pituitary in Wistar rats，leading to increased serum thyroxin level.After forced swimming stress，the TSHβ concentration and mRNA expression level at pituitary in Wistar rats increased（peaked after 12 h），suggesting an importantregulatory role ofthalamus-pituitary-thyroid axisunderacute psychologicaland physiologicalstress.

free triiodothyronine；free thyroxin；thyroid-stimulating hormone；thyroid-stimulating hormone β subunit

R714.1

A

0258-4646（2014）12-1088-04

遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團隊項目（LT2012015）

姜雅秋（1968-），女，教授，博士. E-mail：jiangyaqiu@yeah.net

2014-10-09

網(wǎng)絡(luò)出版時間：