陳瑤，崇巍，王丹娜，趙倩雯，鄧云蕾

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001）

百草枯對巨噬細胞的毒性作用及ROS、IL?6和TNF?α產(chǎn)生的影響

陳瑤，崇巍，王丹娜，趙倩雯，鄧云蕾

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001）

目的研究百草枯對巨噬細胞的毒性作用及對活性氧（ROS）、白細胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）產(chǎn)生的影響。方法不同濃度百草枯作用小鼠巨噬細胞RAW264.7，分別在1，2，8 h收取細胞和細胞培養(yǎng)液，檢測細胞生存率及細胞內(nèi)ROS（化學熒光法），細胞培養(yǎng)液IL-6、TNF-α（ELISA法）。結果在實驗觀察的8 h內(nèi)，0.001、0.01、0.1 mmol/L百草枯作用的RAW264.7存活率沒有明顯變化，10 mmol/L和1 mmol/L百草枯作用其存活率分別在2 h和8 h開始下降。1 h時，隨著百草枯濃度增加，細胞內(nèi)ROS熒光強度遞增；從2 h開始，1 mmol/L和10 mmol/L百草枯細胞內(nèi)ROS熒光強度下降。隨著百草枯濃度從0.001 mmol/L增加到1 mmol/L，細胞培養(yǎng)液中的IL-6的濃度遞增；當百草枯濃度增加到10 mmol/L時，細胞培養(yǎng)液中的IL-6濃度下降。細胞培養(yǎng)液中的TNF-α濃度隨著百草枯濃度增加和作用時間的延長而增加（除外10 mmol/L百草枯作用8 h）。結論高濃度的百草枯對巨噬細胞產(chǎn)生毒性作用，適當濃度的百草枯使巨噬細胞ROS、IL-6及TNF-α的產(chǎn)生增加。

百草枯；巨噬細胞；活性氧；白細胞介素6；腫瘤壞死因子α

百草枯（paraquat，PQ），化學名為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種常見的快速滅生性除草劑，廣泛應用于很多國家，特別是一些亞洲國家［1］。隨著PQ在農(nóng)業(yè)中廣泛應用，國內(nèi)急性中毒日趨增多。PQ對人畜毒性很高，目前仍缺乏有效的解毒劑，臨床死亡率高達60%～80%［2］。氧化應激誘導的全身炎性反應綜合征是其公認的致病機制，肺是主要的靶器官。越來越多的證據(jù)表明PQ產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可通過作用于肺泡巨噬細胞導致肺部的嚴重損傷［3，4］。急性肺損傷可誘發(fā)多臟器功能不全綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。即便患者能渡過急性期，晚期多死于肺間質(zhì)纖維化所致的呼吸衰竭［5］。已有的地塞米松、強的松、環(huán)磷酰胺、血液灌洗、血液透析、肺移植，包括中醫(yī)中藥等治療方法療效均不確切，且常規(guī)的治療措施對患者的長期生活質(zhì)量和預后沒有明顯的改善作用［6～12］。巨噬細胞屬于先天免疫系統(tǒng)，是防御病原體入侵的第一道防線，在炎癥與修復、獲得性免疫反應的協(xié)調(diào)以及組織穩(wěn)態(tài)的維持過程中起著至關重要的作用。巨噬細胞作為炎性反應的重要啟動者和調(diào)節(jié)者，ROS是其炎性活化的因子之一。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為研究對象，觀察不同濃度PQ對巨噬細胞的毒性以及ROS、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細胞RAW264.7（ATCC公司）在含有10%胎牛血清（Invitrogen公司）細胞培養(yǎng)液中及細胞培養(yǎng)箱中生長，細胞操作主要在超凈操作臺上完成。選擇PQ（Sigma公司）的濃度梯度為0.001、0.01、0.1、1、10 mmol/L［1］。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度PQ下RAW264.7細胞存活率檢測：待75 cm2培養(yǎng)瓶（Corning公司）生長達到80%左右的接觸率時，將細胞平均加入18個25 m2培養(yǎng)瓶（Corning公司）中，待瓶中的細胞生長達到80%左右接觸率時，吸出上清，更換為0.5%胎牛血清細胞培養(yǎng)液，放回細胞培養(yǎng)箱過夜。次日取出25 m2培養(yǎng)瓶，每3個培養(yǎng)瓶為1個PQ濃度處理組，分別加入預先配制好的濃度分別為0.001、0.01、0.1、1、10 mmol/L PQ處理液，對照組為不含PQ的0.5%胎牛血清細胞培養(yǎng)液，將所有25 m2培養(yǎng)瓶放回細胞培養(yǎng)箱。分別在處理1 h、2 h和8 h時每組各取出1個培養(yǎng)瓶。吸出上清，離心后凍存待測。用臺盼藍溶液檢測活細胞比率。

1.2.2 不同濃度PQ下RAW264.7內(nèi)ROS的化學熒光法檢測：將細胞懸液加入96孔黑色底透細胞培養(yǎng)板（Greiner公司）中，待細胞培養(yǎng)板中的細胞生長達到80%左右接觸率時，吸出上清，更換為0.5%胎牛血清細胞培養(yǎng)液，放回細胞培養(yǎng)箱過夜。次日取出96孔細胞培養(yǎng)板，每3個細胞培養(yǎng)孔為1個PQ處理組，分別加入預先配制好的濃度分別為0.001、0.01、0.1、1和10 mmol/L PQ處理液，對照組加不含PQ的0.5%胎牛血清細胞培養(yǎng)液，將96孔細胞培養(yǎng)板放回細胞培養(yǎng)箱。分別在1 h、2 h和8 h后取出細胞培養(yǎng)板，PBS清洗2次后，加入DCFH-DA（Sigma公司），放回細胞培養(yǎng)箱。25 min后取出細胞培養(yǎng)板，置于CISBIO公司TECAN F200PRO Microplate Reader上檢測ROS的熒光強度，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.2.3 不同濃度PQ下RAW264.7細胞IL-6和TNF-α的ELISA法檢測：細胞上清中IL-6和TNF-α使用R&D公司ELISA試劑盒檢測，嚴格按試劑盒說明書步驟進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 PQ對RAW264.7細胞存活率的作用

不同濃度PQ作用RAW264.7細胞1 h時，RAW264.7細胞存活率未有明顯改變。10 mmol/L PQ使RAW264.7細胞存活率在2 h時開始下降。1 mmol/L PQ和10 mmol/L PQ使RAW264.7細胞存活率在8 h時開始下降，10 mmol/L PQ的作用更為顯著。見表1。

表1 不同濃度的PQ對RAW264.7生存率的作用Tab.1 Effect of PQ on the survival rate of RAW264.7

2.2 PQ對RAW264.7細胞內(nèi)ROS的作用

不同濃度PQ作用RAW264.7細胞1 h時，細胞內(nèi)ROS熒光強度隨著PQ濃度的增加而加強。在2 h和8 h時，隨PQ濃度從0.001 mmol/L增加到0.1 mmol/L，RAW264.7細胞內(nèi)ROS熒光強度逐漸增強；當PQ濃度提高到1 mmol/L和10 mmol/L時，細胞內(nèi)ROS熒光強度減弱。0.01 mmol/L PQ作用2 h和0.1 mmol/L PQ作用8 h，細胞內(nèi)ROS熒光強度較同時間對照組顯著增強（P＜0.05）。見表2。

2.3 PQ對RAW264.7產(chǎn)生IL-6的作用

在實驗觀察的8 h之內(nèi)，隨著作用時間增加，同PQ濃度作用組細胞培養(yǎng)液中IL-6的濃度遞增。不同濃度PQ作用RAW264.7細胞1 h時，0.001 mmol/L到0.1 mmol/L PQ使細胞培養(yǎng)液中IL-6的濃度較對照組顯著增加（P＜0.05）。不同濃度PQ作用RAW264.7細胞2 h時，0.001～10 mmol/L PQ使細胞培養(yǎng)液中IL-6的濃度較對照組顯著增加（P＜0.05）。不同濃度PQ作用RAW264.7細胞8 h時，0.001～1 mmol/L PQ使細胞培養(yǎng)液中IL-6的濃度較對照組顯著增加（P＜0.05）。見表3。

表2 不同濃度PQ對RAW264.7內(nèi)ROS的作用Tab.2 Effect of PQ on ROS production of RAW264.7

表3 不同濃度PQ對RAW264.7產(chǎn)生IL?6的作用Tab.3 Effect of PQ on IL?6 production of RAW264.7

2.4 PQ對RAW264.7產(chǎn)生TNF-α的作用

在1 h、2 h時，隨PQ濃度作用從0.001 mmol/L增加到10 mmol/L，細胞培養(yǎng)液中TNF-α的濃度遞增，且較對照組顯著增加（P＜0.05）。8 h的情況與1 h、2 h略有不同，PQ濃度增加10 mmol/L時細胞培養(yǎng)液中TNF-α的濃度下降。見表4。

表4 不同濃度PQ對RAW264.7產(chǎn)生TNF?α的作用Tab.4 Effect of PQ on TNF?α production of RAW264.7

3 討論

3.1 PQ對巨噬細胞的毒性作用

有關PQ對組織細胞毒性的研究很多，但對巨噬細胞毒性的研究尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，PQ濃度的增加到1 mmol/L時，對小鼠巨噬細胞RAW264.7毒性作用出現(xiàn)。這與Kim等［1］的報道相似：當PQ的濃度從0.001 mmol/L增加到10 mmol/L時，人肺泡上皮A549細胞的存活率逐漸下降，在濃度為1 mmol/L時明顯下降。目前研究公認PQ的毒性作用與氧化還原循環(huán)反應有關。進入人體后，PQ可被還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）-細胞色素P450還原酶、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）：泛醌氧化還原酶、黃嘌呤氧化酶及一氧化氮合酶這4種酶還原，從NADPH或NADH獲得電子形成PQ·-和NADP+或NAD+，隨后PQ·-在有氧條件下被氧化，將獲得的電子傳遞給O2，形成PQ及O2·-，PQ又繼續(xù)與NADPH或NADH發(fā)生反應。這一過程相當于NADPH或NADH作為電子供體，O2作為電子受體，而PQ起到了催化劑的作用。在超氧化物歧化酶的作用下，O2·-可以轉(zhuǎn)化為其他活性氧自由基，如H2O2和OH-，從而產(chǎn)生一系列的病理生理改變：（1）氧化還原反應大量消耗NADPH及NADH，使許多正常的生化反應無法進行，抑制干擾呼吸鏈電子傳遞，影響生物氧化磷酸化，減少能量合成，引起細胞衰竭；（2）氧自由基可將細胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽氧化為氧化型谷胱甘肽，形成混合性二硫化物，影響細胞代謝及功能；（3）大量氧自由基可引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化，使膜受損，通透性增高，鈣離子通道開放，細胞外鈣離子大量內(nèi)流致細胞內(nèi)鈣超載，破壞細胞功能；可使多種蛋白質(zhì)交聯(lián)失活；可直接損傷DNA［13］。

3.2 PQ增加巨噬細胞ROS、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生

本研究發(fā)現(xiàn)，適當濃度的PQ（如0.1 mmol/L）明顯增加巨噬細胞ROS、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。巨噬細胞作為炎性反應的重要啟動者和調(diào)節(jié)者，ROS是其早期主要炎性活化因子之一。故百草枯使巨噬細胞的IL-6和TNF-α的產(chǎn)生增加與可能ROS增加有關。百草枯誘導產(chǎn)生的活性氧活化肺泡巨噬細胞，合成和釋放大量具有多種生物活性的細胞因子、前炎性介質(zhì)、趨化因子及蛋白酶等，在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義［13］。ROS可能通過核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）導致巨噬細胞增加上述致炎細胞因子的產(chǎn)生。NF-κB是一種廣泛存在于各種細胞、具有多種調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。它調(diào)控的基因編碼急性期反應蛋白、細胞因子、細胞黏附分子、免疫調(diào)節(jié)分子、病毒瘤基因、生長因子、轉(zhuǎn)錄和生長調(diào)控因子等。通過調(diào)控多種基因的表達，NF-κ B參與免疫反應、炎性反應、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進程。在一般狀態(tài)下，細胞內(nèi)大部分NF-κB二聚體通過與細胞質(zhì)中3個抑制因子（IκBa、IκBβ、IκBε）中的一個結合而以無活性的狀態(tài)存在。各種信號通過降解IκBs的方式來活化NF-κB，活化的NF -κB然后進入細胞核內(nèi)與DNA結合。多種作用原，如ROS、紫外輻射、細胞因子（如TNF-α和IL-1），使NF-κB與IκB解離并進入細胞核內(nèi)，與特定的啟動子結合，從而調(diào)控各種基因（如細胞因子、炎性因子、黏附分子等［14］）的表達。

本研究發(fā)現(xiàn)10 mmol/L PQ作用8 h使巨噬細胞ROS、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生減少，系高濃度、長時間的PQ暴露使其對巨噬細胞的毒性作用凸顯出來，從而削弱其對巨噬細胞的致炎作用。此外，PQ增加巨噬細胞IL-6和TNF-α的產(chǎn)生作用存在時相差異：IL-6增加的較慢而TNF-α增加迅速，提示TNF-α和IL-6可能分別是PQ作用巨噬細胞產(chǎn)生急性和亞急性炎性細胞因子。

［1］Kim H，Lee SW，Baek KM，et al.Continuous hypoxia attenuates paraquat-induced cytotoxicity in the human A549 lung carcinoma cell line［J］.Exp Mol Med，2011，43（9）：494-500.

［2］Cory-Slecha DA.Studying toxicants as single chemicals：does this strategy adequately identify neurotoxic risk［J］.Neurotoxicology，2005，26（4）：491-510.

［3］Toygar M，Aydin I，Agilli M，et al.The relation between oxidative stress，inflammation，and neopterin in the paraquat-induced lung toxicity［J］.Hum Exp Toxicol，2014，May 12.［Epub ahead of print］

［4］Yu Q，Nie SP，Wang JQ，et al.Toll-like receptor 4-mediated ROS signaling pathway involved in Ganoderma atrum polysaccharide-induced tumor necrosis factor-α secretion during macrophage activation［J］.Food Chem Toxicol，2014，66：14-22.

［5］Jian XD，Li M，Zhang YJ，et al.Role of growth factors in acute lung injury induced by paraquat in a rat model［J］.Hum Exp Toxicol，2011，30（6）：460-469.

［6］Lee SK，Ameno K，In SW，et al.Levels of paraquat in fatal intoxications［J］.Int J Legal Med，1999，112（3）：198-200.

［7］Li LR，Sydenham E，Chaudhary B，et al.Glucocorticoid with cyclophosphamide for paraquat-induced lung fibrosis［J］.Cochrane Database Syst Rev，2014，8：CD008084.

［8］Chen CM，Lua AC.Lung toxicity of paraquat in the rat［J］.J Toxicol Environ Health A，2000，60（7）：477-487.

［9］Nakamura T，Ushiyama C，Shimada N，et al.Changes in concentrations of typeⅣcollagen tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in patients with paraquate poisoning［J］.J Appl Toxicol，2001，21（6）：445-447.

［10］Jones GM，Vale JA.Mechanisms of toxicity clinical features and management of diquat poisoning：a review［J］.J Toxicol Clin Toxi-col，2000，38（2）：123-128.

［11］Gao Y，Zhang X，Yang Y，et al.Early haemoperfusion with continuous venovenous haemofiltration improves survival of acute paraquat -poisoned patients.［J］.J Int Med Res，2014 Nov 12.［Epub ahead of print］

［12］Wu WP，Lai MN，Lin CH，et al.Addition of immunosuppressive treatment to hemoperfusion is associated with improved survival after paraquat poisoning：a nationwide study［J］.PLoS One，2014，9（1）：1-8.

［13］Dinis-Oliveira RJ，Duarte JA，Sánchez-Navarro A，et al.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment［J］.Crit Rev Toxicol，2008，38（1）：13-71.

［14］Hwang SY，Hwang JS，Kim SY，et al.Glucosamine inhibits lipopolysaccharide-stimulated inducible nitric oxide synthase induction by inhibiting expression of NF-κB/Rel proteins at the mRNA and protein levels［J］.Nitric Oxide，2013，31：1-8.

（編輯 武玉欣）

Toxicity Analysisof Paraquaton Macrophagesand the Effectson Production ofROS，IL-6 and TNF-α

CHENYao，CHONGWei，WANGDan-na，ZHAOQian-wen，DENGYun-lei
（DepartmentofEmergency，The FirstHospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of paraquat（PQ）on macrophages，including the toxicity and the induced production of reactive oxygen species（ROS），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）.MethodsThe RAW264.7 macrophages were treated with different concentrations ofPQfor1 h，2 h and 8 h.The cells and medium were harvested，and the cellviability，intracellular ROS（chemiluminescence method），IL-6 and TNF-α in medium（ELISA）were measured.ResultsThere was no significant difference of the cell viability among 0.001 mmol/L，0.01 mmol/L and 0.1 mmol/L PQ treatment for 8 h，while the decreased cell survival was observed with 1 mmol/L and 10 mmol/L PQ treatment for 2 h and 8 h.The intracellular ROS fluorescent intensity increased at 1 h with a concentration dependent mode of PQ from 0.001 mmol/L to 10 mmol/L. ROS levels decreased with 1 mmol/L and 10 mmol/L PQ treatment for 2 h and 8 h.The IL-6 concentration in the supernatant increased with a concentration dependent mode of PQ from 0.001 mmol/L to 1 mmol/L and decreased when PQ concentration increasing to 10 mmol/L.The TNF-α level in the supernatant increased with the PQ concentration increasing and the treating time extending except for 10 mmol/L PQ at 8 h.ConclusionHigh concentration of PQ shows toxic effect on macrophages，and appropriate concentrations of PQ increases the production of ROS，TNF-α and IL-6 by macrophages.

paraquat；macrophage；reactive oxygen species；interleukin-6；tumor necrosis factor-α

R595.4

A

0258-4646（2014）12-1105-04

遼寧省自然科學基金（201202289）

陳瑤（1982-），女，主治醫(yī)師，碩士研究生.

崇巍，E-mail：chongweixiena@126.com

2014-10-05

網(wǎng)絡出版時間：