底麗娜，南海辰，夏利寧

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

在世界各地及我國(guó)香港，科學(xué)家從報(bào)道的超級(jí)細(xì)菌中提取出了攜帶編碼對(duì)很多抗生素耐藥的新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶的基因［1-2］，β-內(nèi)酰胺酶再度成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。英國(guó)已成立了有關(guān)治療超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）陽(yáng)性大腸埃希菌引起疾病的抗生素資料庫(kù)［3］。TEM型β-內(nèi)酰胺酶是目前世界上最為流行且種類最多的質(zhì)粒編碼的絲氨酸蛋白酶，很多國(guó)家和地區(qū)都有相關(guān)報(bào)道，給臨床抗感染治療帶來(lái)極大的困難。本文就TEM型β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)與流行、分子生物學(xué)特征、耐藥機(jī)制和檢測(cè)方法等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 TEM型β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)與流行

TEM-1由希臘學(xué)者Datta等于1965年首次從大腸埃希菌中分離出，以患者的名字（Temoneira）命名。1969年英國(guó)報(bào)道TEM-1的第一個(gè)變異體TEM-2。1987年，法國(guó)Sirot D等在分離的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了由質(zhì)粒介導(dǎo)的對(duì)頭孢噻肟耐藥的新的β-內(nèi)酰胺酶CTX-1（TEM-3）。1989年，法國(guó)研究員Vedel等首次在大腸埃希菌中分離到耐酶抑制劑的TEM 型β-內(nèi)酰胺酶（inhibitor-resistant TEM，IRT）。1997年Francino M P［4］從大腸埃希菌中分離出了第1株同時(shí)具有ESBLs和IRTs表型的復(fù)合突變 TEM 酶（complex mutant of TEM，CMT）。TEM型ESBLs主要在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)氣腸桿菌、摩根菌、奇異變形桿菌、雷普羅威登斯菌、沙門菌屬等其他腸桿菌中也有報(bào)道［5］。目前TEM型β-內(nèi)酰胺酶的分布已由最初的歐美國(guó)家發(fā)展到世界各地，但各個(gè)國(guó)家、地區(qū)甚至醫(yī)院所占優(yōu)勢(shì)的基因型各不相同。在歐洲主要流行的有TEM-3、TEM-4、TEM-52；美國(guó)、南美主要流行TEM-26、TEM-10；印度的一家醫(yī)院出現(xiàn)過(guò) TEM-92的流行［6］，中國(guó)所分布的TEM酶以TEM-1型最常 見(jiàn)。 近 幾 年 來(lái)，TEM-12［7］、TEM-57［8-9］、TEM-141［10］及 TEM-166［11］等在中國(guó)也相繼被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。

2 TEM型β-內(nèi)酰胺酶的主要生物學(xué)特性

2.1 結(jié)構(gòu)

TEM型β-內(nèi)酰胺酶屬于Ambler分類中的A類，Bush-Jacoby Medeiors功能分類中的2b群。TEM 酶呈酸性，等電點(diǎn)（pI）一般在5.2～6.5。各型TEM基因堿基總長(zhǎng)度均約為900bp。

A類酶的氨基酸序列有較大的同源性，且在三級(jí)結(jié)構(gòu)上非常相似。早在1995年，Knox利用X射線晶體衍射技術(shù)在原子水平展現(xiàn)了A類TEM型β-內(nèi)酰胺酶的三維空間結(jié)構(gòu)，它以絲氨酸為活性中心，具有一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域和圍繞該結(jié)構(gòu)域的5條反向平行β折疊片層。這一組由α螺旋和β折疊所構(gòu)成的功能結(jié)構(gòu)域共同維持著TEM型酶空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且共同構(gòu)成一個(gè)催化腔。催化活性中心Ser70位于α螺旋H2的N端，其邊緣為一氧負(fù)離子穴，β-內(nèi)酰胺底物被緊緊拉向氧負(fù)離子穴并被極化，從而發(fā)生乙酰化和去乙?；乃夥磻?yīng)［12］。

目前已得到了多種β-內(nèi)酰胺酶的晶體結(jié)構(gòu)包括蛋白與藥物、蛋白與藥物分子水解中間體的復(fù)合物等。隨著科學(xué)技術(shù)水平的提高，已有學(xué)者應(yīng)用電子核雙共振光譜、核磁共振等方法、解析并獲取酶的三維結(jié)構(gòu)，展示臨床常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與β-內(nèi)酰胺酶之間的具體相互作用機(jī)制［13］。因此，TEM型β-內(nèi)酰胺酶亞型的三維空間結(jié)構(gòu)逐漸被揭曉。2011年，Docquier J D等［14］報(bào)道了 TEM-72的晶體結(jié)構(gòu)特性。

2.2分類和表型特征

TEM型β-內(nèi)酰胺酶根據(jù)其水解底物譜，可分為4類，即廣譜β-內(nèi)酰胺酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、耐酶抑制劑TEM型β-內(nèi)酰胺酶和復(fù)合突變TEM型β-內(nèi)酰胺酶［6，12］。

2.2.1 廣譜β-內(nèi)胺酶 TEM型廣譜β-內(nèi)胺酶包括TEM-1和TEM-2，其他TEM型酶均由它們衍生而來(lái)。TEM-1是最早被發(fā)現(xiàn)的TEM型，也是最為常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶，在耐氨芐西林的大腸埃希菌中，90%的菌株產(chǎn)生TEM-1。它能夠水解青霉素類和第1代頭孢菌素，對(duì)超廣譜頭孢菌素的水解能力很低，其活性可被克拉維酸所抑制。TEM-2型與TEM-1型相比，只是39位氨基酸殘基發(fā)生了Ser突變?yōu)長(zhǎng)ys，而二者生化特性幾乎完全一致，等電點(diǎn)由5.4變?yōu)?.6，其底物譜無(wú)明顯改變，但產(chǎn)TEM-2的菌株明顯少于TEM-1菌株。TEM-13與TEM-2僅在265位上由蛋氨酸取代酪氨酸，該位點(diǎn)的改變不影響酶活性和酶的底物范圍，所以TEM-13和TEM-1、TEM-2一樣也是廣譜酶。新發(fā)現(xiàn)的TEM-166編碼基因序列與TEM-1相比，1個(gè)核苷酸的改變導(dǎo)致第120位的氨基酸發(fā)生變化，即Arg120→Gly。兩者的耐藥特性幾乎完全相同，對(duì)哌拉西林高度耐藥，但對(duì)第3代頭孢菌素、亞胺培南均敏感［6］。

2.2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 TEM-3是第1個(gè)TEM型ESBLs。TEM型ESBLs均由廣譜酶TEM-1和TEM-2的編碼基因發(fā)生突變?cè)斐?個(gè)～5個(gè)氨基酸改變而形成，如TEM-5、TEM-10來(lái)源于TEM-1而 TEM-16、TEM-22則來(lái)源于 TEM-2。TEM型ESBLs主要見(jiàn)于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，也發(fā)現(xiàn)于其他一些腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌。其表型特征為對(duì)第3代頭孢菌素耐藥，但對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑敏感。與母體酶TEM-1比較，由于TEM型ESBLs活性位點(diǎn)絲氨酸附近出現(xiàn)了1個(gè)～5個(gè)氨基酸殘基的替換，改變了其與底物間的空間構(gòu)效關(guān)系，從而表現(xiàn)為ESBLs的酶動(dòng)力學(xué)特征。其主 要 突 變 位 點(diǎn) 在 Glu104Lys、Argl64Ser/His、Gly238ser和Glu240Lys。突變位點(diǎn)164位精氨酸→絲氨酸、組氨酸，此位點(diǎn)突變可導(dǎo)致底物結(jié)合腔擴(kuò)大，使酶與β-內(nèi)酰胺類抗生素充分發(fā)生作用；104位谷氨酸→賴氨酸、240位谷氨酸→賴氨酸，104和240位點(diǎn)氨基酸取代能加強(qiáng)酶對(duì)頭孢他啶的水解；238位甘氨酸→絲氨酸，見(jiàn)于部分TEM型酶和大部分SHV型酶中，此位點(diǎn)突變可提高酶對(duì)頭孢噻肟的水解能力［15］。

2.2.3 耐酶抑制劑 TEM 型β-內(nèi)酰胺酶 由于酶抑制劑的大量使用，進(jìn)而發(fā)生新的突變，產(chǎn)生耐酶抑制劑TEM型β-內(nèi)酰胺酶IRTs。1991年首次從臨床分離的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，其表型特征為對(duì)β-內(nèi)酰胺酶/克拉維酸耐藥，但對(duì)頭孢菌素類敏感。IRTs的突變位點(diǎn)主要位于69、244和276位上，當(dāng)TEM-1、TEM-2中69位的蛋氨酸被替代時(shí)，由于69位靠近酶的活性位點(diǎn)Ser70，Ser70會(huì)發(fā)生移位（即?；磻?yīng)點(diǎn)移位），會(huì)影響水解反應(yīng)的進(jìn)行［6］。

2.2.4 復(fù)合突變TEM型β-內(nèi)酰胺酶 因TEM變異導(dǎo)致的一些復(fù)雜的TEM變異體CMTs，則兼有ESBL和IRT的突變位點(diǎn)，同時(shí)具有ESBLs和IRTs的特性，能同時(shí)水解第3代頭孢菌素和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，如TEM-50、TEM-68。關(guān)注一下近幾年報(bào)道的復(fù)合突變TEM 型β-內(nèi)酰胺酶的耐藥特征，TEM-125的突變位點(diǎn)既包含ESBLs TEM-12的突變位點(diǎn)，又包含耐酶抑制劑TEM-39（IRT-10）的突變位點(diǎn)，耐藥表型對(duì)頭孢他定耐藥同時(shí)，對(duì)克拉維酸也高水平耐藥［16］。

3 TEM型β-內(nèi)酰胺酶的耐藥機(jī)制

氨曲南是首個(gè)應(yīng)用于臨床的屬單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，該藥物比青霉素類和頭孢菌素類抗生素對(duì)β-內(nèi)酰胺酶表現(xiàn)出了較高的穩(wěn)定性。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，從臨床發(fā)現(xiàn)抗氨曲南的菌株中分離得到TEM型β-內(nèi)酰胺酶的一些突變體，如238位的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸和240位的谷氨酸突變成賴氨酸或者精氨酸（G238S-E240K/R），這些突變都會(huì)對(duì)氨曲南的敏感性有所降低，從而出現(xiàn)耐藥［17］。細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥最主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。編碼ESBLs的基因多位于質(zhì)粒上，位于質(zhì)粒DNA上的ESBLs編碼基因常常可以在接合性質(zhì)粒的tra操縱子、轉(zhuǎn)座子以及整合子的作用通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合方式，在同種屬甚至不同種屬細(xì)菌的質(zhì)粒與質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體間不斷轉(zhuǎn)移，發(fā)生產(chǎn)酶基因的垂直和水平傳播。

β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因突變可引起廣泛耐藥，按突變的位置不同可分為兩類。一類是發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上的突變，其突變的結(jié)果是導(dǎo)致新酶的產(chǎn)生。如TEM和SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶可通過(guò)結(jié)構(gòu)基因上單點(diǎn)或多點(diǎn)突變衍生大量的新型超廣譜酶。第2類突變是發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因以外的區(qū)域，多數(shù)為啟動(dòng)基因或調(diào)節(jié)基因（TEM-1、TEM-2來(lái)源的ESBLs的啟動(dòng)子活性較強(qiáng)），調(diào)節(jié)基因的改變會(huì)造成結(jié)構(gòu)基因的過(guò)度表達(dá)，使產(chǎn)酶量增加而導(dǎo)致耐藥［18］。2013年，孫景勇等［19］研究證實(shí)，在大腸埃希菌中 Pa/Pb啟動(dòng)子調(diào)控的TEM-1β-內(nèi)酰胺酶的高表達(dá)可使細(xì)菌對(duì)哌拉西林-他唑巴坦和頭孢哌酮耐藥，而且這種耐藥基因位于轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒上，可通過(guò)接合轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，給臨床抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

這些突變對(duì)酶主要有3方面的影響：①擴(kuò)大催化腔的空間，使具有較大側(cè)鏈取代基的第3代頭孢菌素能夠進(jìn)入而被水解；②提高對(duì)第3代頭孢菌素的親和力；③抑制酶其他位點(diǎn)的突變，提高酶的穩(wěn)定性，增加酶的產(chǎn)量［20］。

4 檢測(cè)

時(shí)至今日，已有216種TEM型β-內(nèi)酰胺酶（http：//www.lahey.org/Studies/temtable.asp）被發(fā)現(xiàn)，TEM型β-內(nèi)酰胺酶在世界各地的持續(xù)傳播，部分原因是由于缺少可靠、全面的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，人們?cè)褂玫入婞c(diǎn)法、TEM特異的DNA探針、基因芯片法、變相高效液相色譜技術(shù)、PCR測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定，而由強(qiáng)啟動(dòng)子Pa/Pb突變引起TEM-1β-酰胺酶的高表達(dá)在臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的ESBL篩選和確證試驗(yàn)中表現(xiàn)為陰性［21］，容易誤導(dǎo)臨床醫(yī)師錯(cuò)誤地使用第3代頭孢菌素頭孢哌酮，應(yīng)該引起重視。

食源性耐藥菌可通過(guò)多種途徑將耐藥基因傳遞給人類致病菌，不僅危害人類健康，還可引起禽產(chǎn)品中藥物殘留、食品安全問(wèn)題［22］。鑒于TEM基因型耐藥菌株仍然是目前耐藥菌株的主要和常見(jiàn)亞型，近年來(lái)，我國(guó)也逐漸加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物源食品中TEM型β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。如陶虹等［23］采用雙重PCR檢測(cè)方法對(duì)出入境食品安全中TEM和CTX-M的基因檢測(cè)，張立靜［24］采用雙抗夾心法建立了對(duì)牛奶中TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶的膠體金免疫層析方法，制備出快速檢測(cè)試紙條，該試紙條靈敏度、特異性、穩(wěn)定性均良好?？焖贆z測(cè)是臨床及時(shí)合理進(jìn)行抗菌治療的前提，建立一種可靠的檢測(cè)方法能應(yīng)用于實(shí)際生活和實(shí)驗(yàn)室，是當(dāng)今科研人員面臨的任務(wù)。

5 策略

隨著β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的大量使用，TEM型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶水解這些藥物的能力也逐漸加強(qiáng)，主要是活性位點(diǎn)的替換，活性位點(diǎn)的替換導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性降低。無(wú)論何種突變其對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)最終還需要通過(guò)β-內(nèi)酰胺酶分子作為橋梁，目前關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶及突變型的研究大多數(shù)是從試驗(yàn)方面入手，這些試驗(yàn)結(jié)果可以使我們很好的了解近期某個(gè)地區(qū)內(nèi)新型耐藥菌株的產(chǎn)生和變化，以利于選擇可以達(dá)到臨床治愈效果的β-內(nèi)酰胺類抗生素。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已廣泛用于研究蛋白-藥物、蛋白-蛋白以及蛋白-DNA/RNA作用機(jī)制的分子動(dòng)力學(xué)模擬在研究β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶等靶標(biāo)之間的相互作用機(jī)制中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用［13］。因此，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶與底物之間構(gòu)效關(guān)系的研究是酶介導(dǎo)的耐藥機(jī)制研究中的另一個(gè)重要方面，并且逐漸成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

Brown N G等［25］發(fā)現(xiàn)一種 M182T替代物，可作為TEM-1β-內(nèi)酰胺酶的抑制基因，如能將其與藥物有機(jī)地結(jié)合，便可提高藥物的穩(wěn)定性，減少細(xì)菌耐藥。Drawz S M等［26］根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶活性和耐藥機(jī)制，有望在未來(lái)30年里，研制出一種能恢復(fù)β-內(nèi)酰胺類抗生素活性的“第2代”β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。我國(guó)班一禾課題組從蛋白酶與抗生素相互作用的角度出發(fā)，運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合分子對(duì)接，結(jié)合自由能計(jì)算等方法選取TEM型β-內(nèi)酰胺酶-氨曲南為研究對(duì)象，圍繞酶突變后對(duì)藥物分子氨曲南的敏感性降低展開(kāi)，對(duì)酶突變后與氨曲南的結(jié)合模式改變情況進(jìn)行分析并找到結(jié)合力改變的原因，從分子水平解釋了靶標(biāo)和藥物之間的相互作用模式，對(duì)基于該靶標(biāo)設(shè)計(jì)新型β-內(nèi)酰胺類抗生素的研發(fā)工作起著重大作用。同時(shí)這些計(jì)算方面的方法和結(jié)果對(duì)今后進(jìn)一步研究TEM型β-內(nèi)酰胺酶家族以及其與β-內(nèi)酰胺類抗生素尤其是第3代、第4代頭孢菌素和單酰胺環(huán)類抗生素的相互作用機(jī)理提供了新的思路，也為解決臨床新型抗生素的設(shè)計(jì)問(wèn)題提供了參考［13］。

6 結(jié)語(yǔ)

總之，隨著抗生素的使用日益增多，新的TEM型β-內(nèi)酰胺酶在世界各地不斷被發(fā)現(xiàn)，其衍變規(guī)律還有待于進(jìn)一步揭示。目前，多數(shù)ESBLs三維空間結(jié)構(gòu)與底物構(gòu)效關(guān)系的闡述還停留在現(xiàn)有模型的推測(cè)上。我國(guó)需加強(qiáng)科研能力，從分子水平上對(duì)β-內(nèi)酰胺酶與抗生素相互作用的機(jī)制、產(chǎn)酶基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行更深入研究。通過(guò)加強(qiáng)此方面的深入研究，將為分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和預(yù)防、指導(dǎo)臨床工作者合理使用抗生素以及新藥設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)提供有力的理論依據(jù)。

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