陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周璟明 鄭榕

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007）

鏈霉素抗性突變理性篩選新霉素高產(chǎn)菌株

陳宏 張祝蘭 孫菲 張引 周璟明 鄭榕

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007）

采用化學(xué)誘變劑NTG結(jié)合鏈霉素抗性篩選法獲得新霉素高產(chǎn)菌株。出發(fā)菌株費(fèi)氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）FS1109的孢子懸液經(jīng)不同劑量的化學(xué)誘變劑NTG處理后，涂布在含鏈霉素最小抑制濃度（3 μg/mL）的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，獲得大量的鏈霉素抗性突變株。經(jīng)影印法初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，正突變率高于負(fù)突變率，獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的Streptomyces fradiae Str 63菌株，其新霉素生物活性單位比出發(fā)菌株提高了50%以上，且C組分較出發(fā)菌株的低。

費(fèi)氏鏈霉菌 新霉素 鏈霉素抗性篩選 突變

新霉素（Neomycin）系由費(fèi)氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）［1］產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素［2，3］，是一種理想的干擾蛋白質(zhì)合成的殺菌劑［4］，在臨床和獸醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用，近年來市場(chǎng)對(duì)新霉素的需求急劇增長。新近的研究發(fā)現(xiàn)，新霉素能通過阻遏成纖維生長因子和內(nèi)皮生長因子來干擾血管的形成，可能發(fā)展成為抗癌藥物［5-7］。此外，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)其具有巨大的抗HIV潛力，且新霉素A、B及其衍生物具有細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)［8］。

目前，國內(nèi)新霉素生產(chǎn)中普遍存在菌種發(fā)酵水平波動(dòng)性大，低產(chǎn)率高單耗等嚴(yán)重缺陷，優(yōu)良新霉素菌種的選育已成為提高新霉素產(chǎn)量和質(zhì)量的首要任務(wù)。在菌種選育過程中，面臨的首要問題是巨大的篩選工作。根據(jù)分子育種中關(guān)于抗生素產(chǎn)生菌抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因緊密連鎖而容易發(fā)生共突變的理論［9］，采用抗生素抗性篩選可以在較大程度上減少抗生素高產(chǎn)菌篩選的盲目性和不定向性，提高對(duì)目的菌的篩選效率，極大地減少誘變篩選的工作量。鏈霉素抗性篩選具有廣譜性、正突變率和增產(chǎn)百分率高等特點(diǎn)，以鏈霉素抗性作為選擇壓力，對(duì)許多抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行推理選育所得到的突變株中都有較高的高效價(jià)突變株出現(xiàn)

的頻率［10-14］。

本研究采用化學(xué)誘變劑亞硝基胍（NTG）誘變處理使孢子產(chǎn)生DNA高頻率突變，結(jié)合鏈霉素抗性篩選法，獲得鏈霉素抗性突變株以篩選新霉素高產(chǎn)菌株，旨為工業(yè)化高效發(fā)酵生產(chǎn)新霉素提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae FS 1109，指示菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus CPCC-160020，由福建省微生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基［15］：0.5%蛋白胨，2.8%花生餅粉，0.5%酵母粉，8.0%米粉，2.0%葡萄糖，0.25%玉米漿，0.025%淀粉酶，0.6%硫酸銨，0.45%碳酸鈣，pH7.2。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉素抗性突變株的制備

1.2.1.1 鏈霉素對(duì)Streptomyces fradiae FS 1109菌株孢子最小抑制濃度的測(cè)定 將制備好出發(fā)菌株的孢子懸液（濃度106個(gè)/mL）涂布在含不同濃度鏈霉素（1、2、3、5、10和20 μg/mL）的高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)8 d，觀察平板上菌落生長情況。記錄未長菌落平板上的鏈霉素最低濃度，即為鏈霉素對(duì)該菌的最小抑制濃度。

1.2.1.2 亞硝基胍誘變 亞硝基胍（NTG，F(xiàn)luka Inc.）0.1 g，加少量的丙酮溶解后用Tris 緩沖液（pH8.0 Tris-HCl）配制不同濃度的NTG 溶液；用已滅菌的Tris 緩沖液制備孢子懸液，取孢子懸液與NTG 溶液按1∶1 混合，于28℃振蕩處理20 min，用Tris 緩沖液稀釋終止反應(yīng)。

1.2.1.3 鏈霉素抗性突變株的篩選 NTG誘變處理的孢子稀釋液分別涂布在含最小抑制濃度鏈霉素和空白對(duì)照培養(yǎng)平板上，28℃培養(yǎng)10 d，分別進(jìn)行不同處理的菌落計(jì)數(shù)，凡是在含最小抑菌濃度鏈霉素平板上長出來的菌落均為鏈霉素抗性突變株。

1.2.2 鏈霉素抗性突變株高產(chǎn)菌株的篩選

1.2.2.1 初篩單菌落 分別將誘變的突變菌落挑接在高氏斜面上，并采用影印法將突變菌落進(jìn)行生物活性檢測(cè)。

1.2.2.2 搖瓶復(fù)篩 采用劃線法將初篩入選菌株接種于裝有一定量發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中35℃、220 r/min培養(yǎng)135 h，進(jìn)行發(fā)酵生物效價(jià)測(cè)定及采用HPLC-EDC法檢測(cè)組分。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物效價(jià)檢測(cè) 參照《中國藥典》2010 版抗生素微生物檢定法（附錄XI A），效價(jià)為3次平均值，以相對(duì)值標(biāo)示。

1.2.3.2 新霉素C組分測(cè)定 采用HPLC-ECD方法。分離條件 Agilent zorbax-SB C18（5 μm，4.6×250 mm）色譜柱，以25 mL/L TFA+6 mL/L NaOH（50%，W/W）作為流動(dòng)相，流速0.7 mL/min；柱后衍生液0.5 mol/L NaOH溶液，流速1 mL/min；電化學(xué)參數(shù)，E1=+0.1 V，E2=+0.8 V，E3=-0.6 V。

2 結(jié)果

2.1 鏈霉素抗性（Str）突變株的制備

2.1.1 鏈霉素對(duì)Streptomyces fradiae FS 1109菌株孢子的最小抑制濃度的確定 在試驗(yàn)中，當(dāng)鏈霉素濃度≥3 μg/mL時(shí)，平板上無菌落生長。因此鏈霉素對(duì)FS 1109菌株孢子的最小抑菌濃度為3 μg/mL。

2.1.2 NTG對(duì)SF 1109菌株孢子的誘變效應(yīng) 通過不同濃度的NTG對(duì)SF1109菌株孢子的誘變作用，將各種處理濃度的孢子懸液稀釋不同倍數(shù)后分別涂布在含鏈霉素3 μg/mL和不含鏈霉素平板上，28℃培養(yǎng)10 d，分別作菌落計(jì)數(shù)，凡是在含鏈霉素3 μg/mL平板上長出來的菌落均為鏈霉素抗性（Str）突變株，其誘變結(jié)果見表1。

2.2 新霉素高產(chǎn)菌株的篩選

2.2.1 Str突變株高產(chǎn)菌株的篩選結(jié)果 對(duì)SF1109菌株孢子進(jìn)行NTG處理后，涂布在含3 μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，從中挑取180個(gè)抗性突變菌落進(jìn)行初篩，經(jīng)生物檢測(cè)，以誘變出發(fā)菌株的發(fā)酵生物活性單位為100，計(jì)算突變株的相對(duì)發(fā)酵生物活性（表2），其中73株為正突變菌株（相對(duì)生物活性在110以上），50株為未突變菌株（相對(duì)生物活性在90-110），57株為負(fù)突變菌株（相對(duì)生物活性在90以下）。將初篩獲得的正突變株通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)生物活性檢測(cè)和HPLC-EDC定

量分析，最后選出6株良好的抗性突變株，分別為Str07、Str19、Str63、Str75、Str136和Str153，其中菌株Str63（圖1）新霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株（圖2）提高50%以上，且C組分較出發(fā)菌株低，見表3。

表1 不同濃度NTG對(duì)SF1109菌株孢子致死率與突變率的影響

表2 鏈霉素抗性突變株初篩結(jié)果

圖1 菌株Str 63

圖2 Streptomyces fradiae FS 1109

2.2.2 菌株Str63斜面保藏穩(wěn)定性試驗(yàn) 將菌株Str63接種于斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4℃保藏，測(cè)定保藏不同時(shí)間的菌株的發(fā)酵效價(jià)。以新鮮斜面為對(duì)照，結(jié)果其保藏10、20、30、60、90和120 d的相對(duì)效價(jià)分別為103%、111%、109%、97.6%、99.1%和98.5%。表明菌種斜面在4℃保藏4 個(gè)月穩(wěn)定。

表3 抗性突變菌株高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵情況

2.2.3 菌株Str63傳代穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)菌株Str63連續(xù)傳代培養(yǎng)，以4℃冰箱保存7 d 生長良好的第一代菌株為對(duì)照，結(jié)果其第1、2、3、4和5代的相對(duì)單位分別為100%、103%、99.6%、98.1%和93.2%，表明菌株Str63傳四代對(duì)發(fā)酵水平無明顯影響。提示菌株Str63遺傳穩(wěn)定性較好。

3 討論

新霉素（Neomycin）系由費(fèi)氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）發(fā)酵產(chǎn)生的多組分抗生素，主要產(chǎn)物新霉素B組分相對(duì)其他組分而言活性強(qiáng)、毒性低。因此篩選新霉素發(fā)酵生物活性穩(wěn)定，小組分含量低的高產(chǎn)菌種有利于其工業(yè)化生產(chǎn)，可提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)競(jìng)爭力。

研究結(jié)果也顯示了和相關(guān)文獻(xiàn)［10，13］采用鏈霉素抗性篩選法取得正突變機(jī)率高于負(fù)突變的一致結(jié)果，可推測(cè)該弗氏鏈霉菌的鏈霉素抗性基因突變與新霉素發(fā)酵生物活性突變緊密相關(guān)。鏈霉素抗性是由于編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因或其它基因發(fā)生突變導(dǎo)致核糖體或核糖體蛋白發(fā)生改變而產(chǎn)生，雖然核糖體相關(guān)基因改變對(duì)抗生素產(chǎn)生菌次級(jí)代謝

產(chǎn)物生物合成的影響雖然已有較多研究［16，17］，但不明機(jī)制仍然較多，核糖體相關(guān)基因的改變?nèi)绾握{(diào)控菌株的次級(jí)代謝有待進(jìn)一步探索與研究。

4 結(jié)論

本研究組合運(yùn)用NTG誘變與鏈霉素抗性突變株篩選新霉素高產(chǎn)菌株的方法，獲得了1 株高產(chǎn)新霉素高產(chǎn)的突變菌株Streptomyces fradiae Str63，其新霉素生物活性單位比原出發(fā)菌株提高50%以上，且C組分較出發(fā)菌株的低，為工業(yè)化生產(chǎn)新霉素奠定了基礎(chǔ)。

［1］Rinehart KL Jr, Stroshane RM. Biosynthesis of aminocyclitol antibiotics［J］. Journal of Antibiotics, 1976, 29（4）：319-353.

［2］Huang F, Spiteller D, Koorbanally NA, et al. Elaboration of neosamine rings in the biosynthesis of neomycin and butirosin［J］. Chembiochem, 2007, 8（3）：283-288.

［3］Waksman SA, Lechevalier HA. Neomin, a new antibiotic active streptomycin-resistant bacteria, including tuberculosis organisms［J］. Science, 1949, 109（3）：305-307.

［4］Mehta R, Champney WS. Neomycin and paromomycin inhibit 30S ribosomal subunit assembly in Staphylococcus aureus［J］. Current Microbiology, 2003, 47（3）：237-243.

［5］Hu GF. Neomycin inhibits angiogenin-induced angiogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95（17）：9791-9795.

［6］Hu GF. Neomycininhibits the angiogenic activity of fibroblast and epidermal growth factors［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287（4）：870-874.

［7］魏社鵬, 吳惺, 周范民. 新霉素聯(lián)合苯丁酸鈉對(duì)腦膠質(zhì)瘤抑制作用的機(jī)制研究［J］. 中國臨床神經(jīng)科學(xué), 2005, 13（1）：31-35.

［8］顧覺奮, 陳麗萍. 新霉素A、B及其衍生物抗HIV作用的研究［J］. 國外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè), 2008, 29（4）：154-159.

［9］Chater KF, Bruton CJ. Resistance, regulatory and production genes for the antibiotic methylenonycin are clustered［J］. EMBO J, 1985, 4：1893-1897.

［10］涂國全, 鐘承贊, 黃林, 等．通過獲得鏈霉素抗性基因突變株篩選小諾霉素高產(chǎn)菌株［J］．微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31（4）：19-22．

［11］陶純長, 諶頡, 郭美錦, 等. 鏈霉素抗性突變理性篩選avermectin 高產(chǎn)菌株［J］. 中國抗生素雜志, 2002, 27（9）：521-523, 528

［12］孫玉雯, 崔承彬. 抗生素抗性篩選在微生物菌株選育中的作用［J］. 國際藥學(xué)研究雜志, 2008, 35（3）：213-217.

［13］Hosoya Y, Okamoto S, Muramatau H, et al. Acquisition of certain streptomycin-resistant（str）mutations enhances antibiotic production in bacteria［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1998, 42（8）：2041—2047．

［14］劉體顏, 邢玉華, 戴素琴, 等. 達(dá)托霉素生產(chǎn)菌（ATCC31568）的紫外誘變和抗生素抗性篩選［J］. 中國抗生素雜志, 2013, 38（9）：664-669.

［15］滕慧, 張亞雄. 復(fù)合誘變選育新霉素高產(chǎn)菌株的研究［J］. 中國釀造, 2008（13）：37-39.

［16］胡莎莎, 劉春磊, 孫秀秀, 等. 抗生素產(chǎn)生菌核糖體相關(guān)基因改變與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成［J］. 中國抗生素雜志, 2012, 37（6）：443-442.

［17］陳代杰, 李燕. 細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥性與抗生素產(chǎn)生菌的推理選育［J］. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2001, 32（2）：85-89.

（責(zé)任編輯 李楠）

Streptomycin-resistant Rational Screening for High-yield Neomycin Producing Strain

Chen Hong Zhang Zhulan Sun Fei Zhang Yin Zhou Jingming Zheng Rong
（Fujian Institute of Microbiology，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)uzhou 350007）

NTG mutagenesis and streptomycin resistance screening was applied to screen neomycin high producing strain. A number of streptomycin-resistant（str）mutants were obtained from original strain of Streptomyces fradiae FS1109 treated with three different dosage of NTG under the selection pressure of resistance to streptomycin（the lethal concentration is 3 μg/mL）. Streptomycin-resistant mutants strain Str63 was obtained with high neomycin yield by replica plating method and the neomycin productivity could be more than 50% higher and the component of C was lower than that of the original strain in the rotation-flask experiments, the rate of the positive mutation was larger than that of the negative mutation.

Streptomyces fradiae Neomycin Streptomycin resistance screening Mutation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.029

2014-05-13

國家“十一五”“重大新藥”創(chuàng)制項(xiàng)目（2010ZX09401-403），福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012J01094）

陳宏，高級(jí)工程師，研究方向：微生物菌種選育與發(fā)酵；E-mail：peaceful88@163.com

張祝蘭，研究員，研究方向：微生物藥物；E-mail：jessylan9963@sina.com.