張 銳， 蘭文升， 賀秀媛， 朱家增， 劉 葒， 史秀杰， 歐小雷

(1. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 深圳市外來有害生物檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518045； 2. 廣東海洋大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)部現(xiàn)代生化中心，廣東 湛江 524088； 3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系， 鄭州 450002)

大田軟海綿酸(okadaic acid, OA) 及其衍生物是腹瀉型貝類毒素(DSP)毒素的主要組分, 它能夠抑制蛋白質(zhì)磷酸酶PP1A和PP2A，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)過磷酸化[1]，從而降低了PP1和PP2A對(duì)正常細(xì)胞所具有的抑癌作用，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化[2]。有關(guān)報(bào)道表明，在低濃度不能引起機(jī)體劇烈毒性反應(yīng)時(shí)，OA成為一種潛在的腫瘤促進(jìn)物和誘發(fā)劑，可誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞的凋亡[3， 4]。

有報(bào)道氧自由基(Reactive oxygen species)在細(xì)胞信號(hào)肽中發(fā)揮很重要的作用，并主要存在于細(xì)胞增殖和凋亡過程中[5]。也有研究表明外源性污染物進(jìn)入生物體后， 會(huì)導(dǎo)致大量活性氧自由基的產(chǎn)生[6]，它可以與DNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯(lián)、蛋白-DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因，它使脂的通透性增加，膜結(jié)構(gòu)及其功能受到損傷，最終對(duì)生物體造成損傷[7]。抗氧化系統(tǒng)包括還原性谷胱甘肽(GSH)，過氧化氫酶(CAT), 超氧化物歧化酶(SOD)等，在消除氧自由基，維持細(xì)胞氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用。盡管有很多報(bào)告指出OA能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是各種信號(hào)之間的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的精確連接以及它們的活化機(jī)制，到目前為止還不是很清楚。在我們的學(xué)習(xí)中，就關(guān)于OA能引起細(xì)胞凋亡和氧自由基的關(guān)系，測(cè)定在消除自由基和抗氧化反應(yīng)中起重要作用的3種物質(zhì)：還原性谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、 超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化，旨在找出其中可能的特異性敏感標(biāo)識(shí)物，也為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒素及試劑

軟海綿酸(OA)購自伊普瑞斯科技有限公司(17.7 μM/L 14.2 μg/mL)，毒素標(biāo)準(zhǔn)品用于攻毒時(shí)稀釋10倍。甲醇(小鼠腹膜半數(shù)致死量260 mg/kg)；實(shí)驗(yàn)所用試劑盒:過氧化氫酶(CAT)測(cè)定試劑盒；超氧化物岐化酶(SOD)測(cè)定試劑盒；還原性谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械及儀器

制冰機(jī)(GRANT FM 70A)；高壓滅菌鍋(SYSTEC VX-100;HIRAYAMA)；微孔板式連續(xù)光譜測(cè)試系統(tǒng)(Spectra max plus384)；離心機(jī)(Mikro 22 R)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/C實(shí)驗(yàn)鼠(雄性)，體重20～30 g，年齡均為5周齡。購自北京大學(xué)第三附屬醫(yī)院動(dòng)物房。

1.4 鼠的攻毒方式與劑量

攻毒劑量依據(jù)NRC小鼠腹腔注射的LD50(192 μg/kg)進(jìn)行劑量的確定。將實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。劑量組分為：高劑量組(96 μg/kg)，中劑量組(48μg/kg)，低劑量組(24 μg/kg)，溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組。溶劑對(duì)照所用為甲醇(Methanol)，按照高劑量組(96 μg/kg)注射劑量注射。于攻毒24 h后取其肝臟制備10%組織勻漿液，然后測(cè)定酶活含量。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

染毒24 h后處死小鼠取出肝臟，制備10%組織勻漿，按照購買的測(cè)試試劑盒的操作說明進(jìn)行各種指標(biāo)的測(cè)定。

1.610%組織勻漿的制備

1)取組織塊(0.2～1 g)最少可到2～5 mg，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5或10 mL的小燒杯內(nèi)。

2)用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH值7.4, 0.01 mol/L Tris-HCL, 0.0001M/LEDTA-2Na, 0.01 mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液)或者用0.86%冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用移液管或移液器取總量的2/3的勻漿介質(zhì)或生理鹽水于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天然操作時(shí)要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。

3)將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次(6～8 min)，充分研碎，使組織勻漿化。

4)將制備好的10%勻漿用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)3000 r/min左右離心10～15 min。

5)樣品放于4℃保存，進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS9.1分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。劑量組組間差異性采用t檢驗(yàn)的方式表示，P<0.05表示差異有顯著變化。

2 結(jié)果

2.1 OA毒素對(duì)小鼠肝臟GSH活性的影響

小鼠肝臟GSH活性隨OA的濃度變化如圖1所示。小鼠染毒24 h后，溶劑對(duì)照組(甲醇)和空白對(duì)照組的GSH活性顯著性不明顯(P>0.05)，在試驗(yàn)所設(shè)的各劑量組GSH活性明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，隨著染毒濃度的增加，GSH的活性也逐漸降低，在高劑量組(96 μg/kg)GSH的活性最小，但是高劑量組(96 μg/kg)和中劑量組(48μg/kg)的GSH活性變化值差異性不顯著(P>0.05)。

*—與對(duì)照組比較P<0.05。

2.2 OA毒素對(duì)小鼠肝臟CAT的活性的影響

小鼠肝臟CAT活性隨OA濃度變化如圖2所示，小鼠在染毒24 h后，溶劑對(duì)照(甲醇)組和空白對(duì)照組的CAT活性沒有顯著差異(P>0.05)，染毒濃度在低劑量組(24 μg/kg)時(shí)，CAT活性比起空白對(duì)照組就已受到顯著(P<0.05)的抑制效應(yīng)。隨著染毒濃度的升高，各濃度組受到的抑制效應(yīng)越強(qiáng)烈，在高劑量組(96 μg/kg)時(shí)CAT活性達(dá)到最小值。

*—與對(duì)照組比較P<0.05。

2.3 OA毒素對(duì)小鼠肝臟SOD的活性的影響

小鼠肝臟SOD活性隨染毒濃度的變化如圖3所示，小鼠在染毒OA, 24 h后溶劑對(duì)照組(甲醇)和空白對(duì)照組的SOD活性差異不顯著(P>0.05)。染毒濃度在低劑量組(24 μg/kg)時(shí)SOD的活性已受到顯著的抑制作用(P<0.05)，隨著染毒濃度的增高，SOD的活性受到的抑制效應(yīng)也越強(qiáng)，在高劑量組(96 μg/kg)時(shí)SOD活性最小，但是數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示各濃度組差異并不顯著(P>0.05)。

*—與對(duì)照組比較P<0.05。

3 結(jié)論

小鼠肝臟各種酶GSH、CAT、SOD的活性,小鼠在感染OA毒素后，隨著染毒濃度的增加，GSH的活性也逐漸降低，在高劑量組(96 μg/kg)GSH的活性最小，而CAT和SOD的活性，均為低劑量OA毒素對(duì)CAT和SOD的活性均有顯著抑制效應(yīng), 隨著染毒濃度的升高，各濃度組受到的抑制效應(yīng)越強(qiáng)烈，在高劑量組(96 μg/kg)時(shí)CAT活性達(dá)到最小值。

4 討論

隨著環(huán)境污染的加劇和水生生物棲居環(huán)境的日益惡化, 有毒藻類大量的繁殖對(duì)生物生理功能和抗氧化防御機(jī)制的影響受到了廣泛關(guān)注和探究。有研究認(rèn)為，因外來異物脅迫而引起抗氧化酶活性的改變， 可在一定程度上反應(yīng)出機(jī)體處于逆境脅迫下的生理狀態(tài)， 并對(duì)一些早期污染物具有生物指示作用[8， 9]。探討以抗氧化酶活性的變化規(guī)律作為污染監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)識(shí)物的可能性成為一項(xiàng)十分重要的課題項(xiàng)目[10]。

本次研究的結(jié)果顯示，小鼠染毒24 h后，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組的GSH的活性，CAT酶活性值和SOD酶活性變化顯著性不明顯(P>0.05)，說明溶劑甲醇對(duì)動(dòng)物機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)沒有產(chǎn)生顯著性的影響，當(dāng)毒素作用于動(dòng)物機(jī)體時(shí)不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。GSH是存在于組織中消除氧化損傷的一種重要的分子, 機(jī)體GSH含量的變化直接也可以反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力[11， 12]。本次研究試驗(yàn)中，染毒劑量組的GSH活性顯著低于對(duì)照組，表明染毒OA后，肝細(xì)胞的抗氧化能力受到抑制，細(xì)胞膜的完整性受到損傷。GSH活性在高劑量組(96 μg/kg)和中劑量組(48 μg/kg)間差異性并不顯著(P>0.05)，表明在這2個(gè)劑量組間抑制效應(yīng)的增加并不明顯。表明在本試驗(yàn)中這2個(gè)濃度毒素作用對(duì)GSH的含量變化沒有顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。CAT是抗氧化脅迫反應(yīng)中最為重要的酶，它可以分解氧化脅迫和SOD岐化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[13]。在本次試驗(yàn)中，染毒劑量組的CAT活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的升高，CAT活性越來越低，各濃度差異性也很顯著(P<0.05)，顯示了一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。許多研究表明SOD是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)對(duì)抗細(xì)胞損傷的一種重要的酶，也是指示氧化脅迫的一種重要的指示酶[14]。在本次研究中，SOD活性受到顯著抑制(P<0.05)，表明肝臟細(xì)胞中存在大量氧自由基，并已經(jīng)引起細(xì)胞損傷和DNA損傷，從而導(dǎo)致SOD活性降低。隨著染毒劑量的增加，SOD活性變化不顯著，表明SOD在本次試驗(yàn)的OA各個(gè)濃度組并不敏感。

已經(jīng)有大量有關(guān)毒素對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性毒性和免疫保護(hù)性研究[15-18]，但OA對(duì)小鼠肝臟各種免疫因子相關(guān)酶的影響尚鮮有報(bào)道。

通過本次試驗(yàn)得知，OA毒素作用于動(dòng)物機(jī)體后，會(huì)引起機(jī)體抗氧化物系統(tǒng)(CAT、SOD、 GSH)的活性的變化，其中以CAT活性變化較為顯著，呈現(xiàn)了良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，有望成為OA毒素的特異指示酶。同時(shí)也為我們進(jìn)一步的細(xì)胞水平和分子水平的實(shí)驗(yàn)奠定了一定的基礎(chǔ)。

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