葉 麗， 蔣霞敏， 孫志鵬， 高秀芝， 張澤凌

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

微綠球藻(Nannochloropsisoculata)是一種海洋單細(xì)胞微藻，具有易培養(yǎng)、營養(yǎng)豐富的特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用較為廣泛，是近兩年在泥蚶、蟹、蝦等育苗及輪蟲培養(yǎng)中應(yīng)用較佳的經(jīng)濟餌料[1-4]。微綠球藻作為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等高度不飽和脂肪酸的新來源日益受到國內(nèi)外科研工作者的重視。

目前由于微綠球藻生長速率低，采收困難和藻種退化等問題已嚴(yán)重阻礙微綠球藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。因此高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)微綠球藻藻株的篩選成為當(dāng)前的一個重大課題。采用He_Ne激光、γ射線以及甲基磺酸乙酯(EMS)在微綠球藻育種中的應(yīng)用已見報道[6-9]，而紫外輻射在微綠球藻育種中的應(yīng)用研究尚未見報道。本文針對紫外輻射微綠球藻的誘變效應(yīng)進行研究，以期利用紫外輻射誘變篩選出生長快、高產(chǎn)EPA的優(yōu)良藻株，為海洋微藻的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

試驗用微綠球藻由寧波大學(xué)藻種室提供。采用MAV[10]培養(yǎng)液，智能光照箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照強度 70 μmol·m-2·s-1，溫度 25℃，光暗周期 12 h∶12 h, 培養(yǎng)容器1000 mL三角燒瓶，培養(yǎng)水體1000 mL，每天定時搖動2次。

1.2 紫外誘變與篩選

取對數(shù)生長期的微綠球藻藻液 10 mL 置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，使藻液均勻平鋪在培養(yǎng)皿底部，藻液厚1cm，用30 W 紫外燈，照射距離為50 cm。設(shè)置不同輻照時間(0、5、10、15、20、25和30 min)，各設(shè)3 平行。輻照后立即將藻液接入 100 mL新鮮培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)24 h，后轉(zhuǎn)入智能光照箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.1。經(jīng)數(shù)代培養(yǎng)后，各組重新接種到100 mL新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種密度10×104cell/mL。7 d 后進行生長速率檢測。

1.3 突變株與出發(fā)株的比較試驗

選取生長速率較快的2株突變株(MN-1和MN-2)和出發(fā)株進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)容器5 L三角燒瓶，培養(yǎng)水體5 L，初始接種密度100×104cell/mL，采用室內(nèi)培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：日光燈光源，光照強度 60 μmol·m-2·s-1，水溫 25℃，光暗周期 12 h∶12 h，其他條件同1.1。

1.4 藻體收集與保存

培養(yǎng)至對數(shù)末期，4500 r/min離心(Thermo)5～10 min，蒸餾水洗滌2～3次，離心、收集藻泥，經(jīng)冷凍干燥，低溫(-20℃)保存待用。

1.5 營養(yǎng)成分測定

生物量的測定采用冷凍干燥稱重法；粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法(GB/T5009.5-2010)；多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，總脂含量的測定采用氯仿-甲醇法[12， 13]。脂肪酸的測定：在抽提的總脂中加入5%～6%KOH甲醇溶液(V/V 4∶1)，充N2 1 min，60℃水浴皂化甲酯化[11]，然后用日本SHIMADZU公司QP2010氣相色譜-質(zhì)譜分析儀進行分析，參考脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[12-14]，用面積歸一法計算出各脂肪酸的百分含量(以占脂肪酸含量的百分比表示)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

生長速率K=(lnNt-lnN0)/t，其中Nt表示培養(yǎng)t時間后的細(xì)胞數(shù)，N0表示初始細(xì)胞數(shù)目，t表示試驗時間。數(shù)據(jù)用Excel 2003進行常規(guī)數(shù)據(jù)處理后，用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當(dāng)差異顯著時進行Turkey’s多重比較法進行組間差異顯著性檢驗。實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紫外輻照時間對藻生長速率的影響

在起始密度相同的情況下，7 d后，各處理組藻株的生長速率如圖1所示。與出發(fā)株相比，輻照15 min的突變株(MN-1)和輻照 20 min的突變株(MN-2)，生長速度明顯加快，分別提高了21.08%和6.25%。其余輻射的突變藻株，藻體顏色變淺，生長速率顯著降低(P>0.05)。因此，選擇突變株MN-1和MN-2作實驗用藻株。

圖1 不同紫外輻射時間對微藻生長速率的影響

2.2 生物量比較

微綠球藻突變株與出發(fā)株在生物量的積累上發(fā)生了改變(圖2)。與出發(fā)株(142.3 mg/L)相比，突變株MN-1的生物量增加了15.55%(163.0 mg/L)，差異顯著 (P<0.05)；突變株MN-2的生物量增加了5.62%(150.3 mg/L)，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3 粗蛋白、多糖、總脂含量比較

微綠球藻突變株與出發(fā)株其粗蛋白的含量不同(圖3)。與出發(fā)株的粗蛋白含量(33.01%)相比，突變株MN-1 (32.86%)和突變株MN-2 (27.56%)稍微有所下降，但三者之間均無顯著差異(P>0.05)。

圖 2 突變株與出發(fā)株生物量的比較

微藻的總脂含量也有所改變(圖3)。出發(fā)株的總脂含量僅有23.45%，MN-1和MN-2的總脂含量分別增加了9.81%和7.93%，均顯著高于出發(fā)株(P<0.05)， MN-1和MN-2的總脂無顯著差異(P>0.05)。

紫外輻射處理后突變株的多糖含量也有變化(圖3)。出發(fā)株的多糖含量為1.75%，而突變株MN-1的多糖含量有所下降，為1.62%，與出發(fā)株無顯著差異(P>0.05)，突變株MN-2的多糖含量增加了13.72%，達(dá)到了1.99%，與出發(fā)株及MN-1均存在顯著差異(P<0.05)。

圖 3 突變株和出發(fā)株粗蛋白、多糖、總脂含量的比較(干重基礎(chǔ))

2.4 脂肪酸組成比較

如表1所示，共檢測出9種脂肪酸，包括3種飽和脂肪酸(SFA) 、3種單不飽和脂肪酸(MUFA)和3種多不飽和脂肪酸(PUFA)。3個藻株的脂肪酸組成沒有變化，但脂肪酸各組分含量發(fā)生了改變。SFA以MN-2的含量較高(39.16%)，顯著高于MN-1(31.2%)和出發(fā)株(30.38%)；MUFA以出發(fā)株(34.4%)與MN-1(34.7%)較高，顯著高于MN-2(30.52%)；n9-MUFA以出發(fā)株(11.29%)較高，顯著高于MN-1(9.56%)和MN-2(9.41%)；PUFA 以MN-1(34.41%)與出發(fā)株(35.23%)較高，二者無差異，而出發(fā)株(35.23%)顯著高于MN-2(30.32%)，差異顯著； C20:5(n3)以 MN-1最高(28.10%)，比出發(fā)株(27.59%)增加了1.81%，差異顯著(P<0. 05)，MN-2(22.16%)明顯低于出發(fā)株(P<0. 05)，減少了19.71%；對于n-6PUFA，MN-2含量最高(8.16%)，出發(fā)株次之(7.64%)，MN-1最低(6.31%)。

表 1 突變株與出發(fā)株脂肪酸組成的比較(%)

3 討論

3.1 紫外誘變對微綠球藻生長速率的影響

本實驗通過不同的紫外誘變時間，獲得了6個微綠球藻突變株。其中紫外輻射15 min的突變株(MN-1)和紫外輻射20 min的突變株(MN-2)的生長速率均有不同程度的增加，紫外輻射15 min的突變株MN-1尤為顯著，此時微藻的生長速率達(dá)到了0.39，相對微綠球藻出發(fā)株增加了21.08%；其余時間的紫外輻射突變株的生長速率均有所下降。這是由于紫外輻射對微藻基因的改變是非定向的，不同的紫外輻射引起的突變也各不相同，因此不同微藻突變株的生長速率也不一樣。

3.2 生物量、粗蛋白、多糖及總脂的比較

突變株與出發(fā)株在生物量、粗蛋白和總脂含量上均有不同程度的改變。本實驗通過紫外誘變技術(shù)，得到2株突變藻株，其生物量最高為160.3 mg/L，顯著高于出發(fā)株的142.3 mg/L。 但低于Ma等[15]和Kandiah等[8]的報道，這種差異與出發(fā)藻株有關(guān)。3株微藻的粗蛋白含量為32.56%～33.01%，與黃旭雄等[4]測得的蛋白含量稍有些出入。這可能與微藻的培養(yǎng)條件、樣品處理及檢測條件的不同有關(guān)。而微藻多糖的研究鮮有報道。微藻的總脂含量受諸多因素的影響，F(xiàn)ábregas等[16]指出微綠球藻總脂與光照有關(guān)，Chiu等[17]報道的微綠球藻總脂含量為22.7%～29.7%，具體與CO2的充入量有關(guān)。魏東等[18]報道微綠球藻的總脂含量占干重的20%～54.5%，具體與氮源、N/P和生長期有關(guān)。本試驗測得的微綠球藻總脂肪含量為23.45%～25.75%，與上述報道基本一致。但與Yin等[19]報道微綠球藻總脂15.50%、蔣霞敏等[10]報道微綠球藻總脂6.52%有較大的差異。

紫外輻射引起微綠球藻生物量、粗蛋白、多糖、總脂及脂肪酸含量的變化，可能是因為為微綠球藻吸收紫外光后，微藻的DNA分子形成嘧啶二聚體，二聚體的出現(xiàn)會減弱雙鍵間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對，使分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，誘導(dǎo)微藻體內(nèi)代謝過程的變化，從而產(chǎn)生上述參數(shù)的變化。

3.3 脂肪酸的比較

在3株微藻中均只檢測到9種脂肪酸，與Yin等[19]報道的微綠球藻中檢測到31種脂肪酸有較大出入，這可能與微綠球藻的培養(yǎng)條件、樣品處理及檢測條件的不同有關(guān)。3株微藻均含有豐富的16:0、16:1(n7)、20:5(n3)，其含量均高于19.08%，這與Jane等[7]的研究結(jié)果相一致。但與Ma等[15]、Thi等[9]報道的含量最高的脂肪酸為16:0、16:1(n7)有出入。突變株MN-2在MAV培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的飽和脂肪酸(SFA)含量為39.16%，顯著高于出發(fā)株和突變株MN-1，而 Thi等[9]報道的微綠球藻EMS突變株在 f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 d 時SFA的含量可達(dá)45.9%，Ma[15]等報道的微綠球藻重離子束誘變株在BG-11培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d時SFA的含量可達(dá)58.1%。3株微藻的MUFA含量為30.52%～34.7%，這與Ma[15]等報道的微綠球藻及其突變株的MUFA含量為29.7%～38.5%接近，但與Thi[9]等報道的微綠球藻及其隨機突變株的MUFA含量34.8%～45.8%有差異。3株微藻的PUFA含量為30.32%～35.23%， 其中2個突變株的總脂含量雖有不同程度的增加，但PUFA的含量均有所降低。這與李秀波等[20]報道的微藻PUFA含量隨著其油脂含量的增加而下降相符合。在Ma[15]等的報道中也出現(xiàn)了同樣的趨勢。3株微藻的EPA含量為22.16%～28.10%，遠(yuǎn)高于Ma[15]等報道的微綠球藻及其突變株EPA含量(6.1%～11.8%)，但Yin[19]等報道的微綠球藻的EPA含量高達(dá)38.39 %，原因可能是培養(yǎng)條件、檢測方法及藻種的不同所導(dǎo)致的。

4結(jié)論

本次研究從6株突變株中篩選出了2株生長率高于出發(fā)株的藻株MN-1和MN-2，并在指數(shù)生長末期對其與出發(fā)株就生物量、粗蛋白、多糖、總脂及脂肪酸進行了比較發(fā)現(xiàn)：MN-1的生長速率增加21.08%，生物量增加14.55%，粗蛋白含量增加2.54%，總脂含量增加9.81%， EPA增加1.81%，SFA增加2.70%； MN-2的生長率增加6.25%，生物量增加5.62%，多糖增加13.26%，總脂增加7.93%， SFA增加28.9%。結(jié)合微藻生長特性，并從生物量、粗蛋白含量、多糖含量、總脂含量及脂肪酸組成等營養(yǎng)學(xué)角度綜合考慮，通過紫外誘變改良微綠球藻具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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