汪建中， 李艷如， 龔華銳

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 安徽 蕪湖 241000)

在食品工業(yè)中，常用抗氧化劑防止食品的氧化變色或者因氧化導(dǎo)致的品質(zhì)劣變[1]。已有的研究表明，食品中常用的合成抗氧化劑BHA和BHT對(duì)動(dòng)物可能有致癌性[2]，因此，人們希望開發(fā)來源于動(dòng)、植物無毒副作用的抗氧化劑。而食用菌營(yíng)養(yǎng)豐富，天然安全，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及產(chǎn)生抗生素等多種生理活性[3, 4]，是尋找天然抗氧化劑的理想材料。

多糖類物質(zhì)普遍存在于食用菌中，是其重要的生物活性成分之一，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[5]。平菇(Pleurotusostreatus)是目前廣泛栽培的食用菌之一，從其子實(shí)體、菌絲體以及發(fā)酵液中都可以獲得平菇多糖。近年來，平菇多糖抗氧化活性的研究越來越受到人們關(guān)注。如程超等的研究表明，平菇子實(shí)體多糖對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基具有清除作用[6]。曹向宇等采用酶法提取、離子交換層析和凝膠過濾純化平菇菌絲體多糖，結(jié)果表明，純化后的平菇菌絲體多糖具有清除超氧離子自由基、羥自由基的能力以及抑制紅細(xì)胞溶血的生成，且呈現(xiàn)一定的效量關(guān)系[7]。也有研究表明，同一種食用菌的3種多糖的抗氧化能力一般存在差異[8, 9]。本文以深層培養(yǎng)平菇獲得的菌絲體、發(fā)酵液為原料，比較研究了其菌絲體、發(fā)酵液多糖清除DPPH自由基、羥自由基以及鐵離子螯合能力和還原力等抗氧化能力，希望為開發(fā)天然安全的食品藥品抗氧化劑提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

平菇(Pleurotusostreatus)由安徽師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

平菇斜面培養(yǎng)基： PDA培養(yǎng)基。

平菇液體菌種培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、硫酸鎂0.05%、氯化鈣0.01%、磷酸二氫鉀0.05%。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖3%，蛋白胨0.2%，麩皮1%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.05%。

1.3 試劑

DPPH自由基、菲洛嗪等購(gòu)自Sigma公司；VC、EDTA二鈉鹽、無水乙醇、雙氧水、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸二氫鉀等購(gòu)自無錫展望化工廠。所有試劑均為分析純。

1.4 儀器

SKY2102C恒溫?fù)u床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；GUCS-10發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；HH-4恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；TD5A-WS離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；FD-1D-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-3802紫外可見分光光度計(jì)，優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司；AR-1140型電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.5 平菇多糖的制備

10 L發(fā)酵罐裝液體培養(yǎng)基7 L，接種10%(v/v)的平菇液體菌種，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)170 r/min，通氣量4 NL/min，26.5℃恒溫培養(yǎng)4 d，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾固液分離獲得菌絲體和發(fā)酵液。

將菌絲體水洗、50℃烘干后磨碎，100目過篩，與蒸餾水按固液比1∶30(W/V)的比例混合均勻，于95℃回流提取2 h， 4000 r/min離心10 min，沉淀重復(fù)提取1次，合并2次上清液。將上清液經(jīng)減壓濃縮至適當(dāng)體積得水提浸膏，加入4倍體積的95%乙醇、4℃沉淀24 h后，4000 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)冷凍干燥(-45℃)后得菌絲體多糖。

發(fā)酵液經(jīng)4000 r/min離心10 min后，取上清液減壓濃縮至適當(dāng)體積得浸膏，加入4倍體積的95%乙醇、4℃沉淀24 h后，4000 r/min離心10 min，沉淀經(jīng)冷凍干燥(-45℃)后得發(fā)酵液多糖。

1.6 平菇多糖的紫外光譜

取適量多糖，配成1.5 mg/mL的水溶液，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.7 平菇多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.7.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定[10]

4 mL反應(yīng)混合液中含有0.04 mg/mL的DPPH 溶液2 mL，多糖樣品溶液2 mL。迅速混勻后，室溫條件下，黑暗環(huán)境中靜置30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)其吸光度。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，以50%的乙醇溶液作參比。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。根據(jù)下面公式計(jì)算多糖樣品的DPPH自由基清除率：

SE/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：SE為清除率；A0為以蒸餾水代替樣品時(shí)溶液的吸光度；A1為加有樣品或陽性對(duì)照時(shí)溶液的吸光度；A2為以無水乙醇代替DPPH 時(shí)溶液的吸光度。

1.7.2 羥自由基清除能力測(cè)定[11]

3 mL反應(yīng)混合液中含有20 mmol/L的水楊酸鈉溶液0.3 mL，1.5 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液1.0 mL，多糖樣品溶液1.0 mL，最后加入6 mmol/L的H2O20.7 mL。迅速混勻后，37℃恒溫水浴1 h，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)其吸光度。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，以蒸餾水作為參比。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取其平均值。根據(jù)下面公式計(jì)算多糖樣品的羥自由基清除率：

SE/%=[ (A0-A1)/A0]×100

式中：SE為清除率；A0為以蒸餾水代替樣品的吸光度；A1為加有樣品或陽性對(duì)照后的吸光度。

1.7.3 鐵離子螯合能力測(cè)定[12]

5 mL反應(yīng)混合液中含有2 mmol/L 的氯化亞鐵溶液0.1 mL，蒸餾水3.7 mL，多糖樣品溶液1 mL，最后加入5 mmol/L的ferrozine溶液0.2 mL，迅速混勻，在室溫條件下靜置20 min，于波長(zhǎng)562 nm處測(cè)其吸光度。吸光度越低，說明多糖樣品的鐵離子鰲合能力越強(qiáng)。以EDTA-二鈉鹽作為陽性對(duì)照，蒸餾水作參比。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取其平均值。根據(jù)下面的公式計(jì)算多糖樣品的鐵離子鰲合能力：

鐵離子鰲合能力(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式中：A0為以蒸餾水代替樣品的吸光度；A1為加有樣品或陽性對(duì)照后溶液的吸光度。

1.7.4 還原能力測(cè)定[13]

向試管中加入pH值6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL，多糖樣品溶液1 mL，1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，迅速混勻，50℃恒溫水浴、黑暗條件下反應(yīng)20 min，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分振蕩后，4000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL，0.1% 的FeCl3溶液0.5 mL，常溫反應(yīng)5 min后，于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度。吸光度越高，說明這種反應(yīng)混合物的還原力越強(qiáng)。以抗壞血酸為陽性對(duì)照，蒸餾水作為參比。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取其平均值。

1.7.5 EC50值

EC50值是指清除率達(dá)到50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度，是評(píng)價(jià)真菌粗多糖抗氧化活性的一個(gè)重要參數(shù)，可根據(jù)不同質(zhì)量濃度樣品的清除率曲線得出。EC50值越低表明樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中的EC50值分別指當(dāng)DPPH自由基、羥自由基清除率、鐵離子螯合能力為50%以及還原力實(shí)驗(yàn)中在波長(zhǎng)700 nm處OD值為0.5時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度，該值由統(tǒng)計(jì)分析的回歸方程計(jì)算得出。

1.8 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，結(jié)果取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的紫外光譜

由圖1可知，在260和280 nm處，2種多糖均未發(fā)現(xiàn)有特征吸收峰，表明它們均不含核酸和蛋白質(zhì)。

2.2 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖清除DPPH自由基能力的比較

當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH 自由基接受一個(gè)電子或氫原子，形成穩(wěn)定的化合物，使其乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與其接受的電子數(shù)量(自由基清除活性)成定量關(guān)系，因此可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速定量分析。另外DPPH 自由基結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，反應(yīng)容易控制。因此DPPH自由基被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)動(dòng)、植物提取物或單一化合物的抗氧化能力實(shí)驗(yàn)中。由圖2可知，2種多糖均具有DPPH自由基清除活性。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其清除率也隨之增加。當(dāng)濃度為15 mg/mL時(shí)，它們的清除率均達(dá)到最大值，分別為77.60%和64.33%。菌絲體、發(fā)酵液多糖的EC50值分別為2.20 mg/mL和6.79 mg/mL，表明這2種多糖都具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖1 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的紫外光譜

圖2 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的DPPH自由基清除能力

圖3 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的羥自由基清除能力

2.3 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖清除羥自由基能力的比較

羥自由基是已知活性最強(qiáng)的活性氧自由基，可嚴(yán)重?fù)p害生物體內(nèi)相鄰的生物分子，引起細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老和癌變等。因此，清除羥自由基可能是生物體抵御疾病的最有效方式之一[14]。由圖3可知，2種多糖均具有羥自由基清除活性，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其對(duì)羥自由基的清除率也隨之增加，菌絲體、發(fā)酵液多糖清除率最大值分別為86.30%和91.43%，EC50值分別為0.89 mg/mL和0.72 mg/mL，表明這2種多糖均具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

2.4 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖鐵離子螯合能力的比較

存在于生物體系中的鐵離子能夠通過Fenton類型反應(yīng)促進(jìn)脂類物質(zhì)的氧化，還可以使脂類氧化后的氫過氧化物降解產(chǎn)生自由基來傳遞氧化反應(yīng)鏈，當(dāng)螯合劑存在時(shí)可以降低其氧化能力，從而起到抗氧化作用[15]。因此，鐵離子鰲合能力就成為評(píng)估各種植物及真菌提取物抗氧化能力的一項(xiàng)指標(biāo)。由圖4可知，2種多糖均具有鐵離子螯合能力。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，它們對(duì)鐵離子的螯合能力也隨之增加。當(dāng)濃度為15 mg/mL時(shí)，菌絲體、發(fā)酵液多糖的鐵螯合能力最強(qiáng)，分別為49.86%和75.46%。菌絲體、發(fā)酵液多糖的EC50值分別為11.83 mg/mL和3.32 mg/mL，表明發(fā)酵液多糖的鐵離子螯合能力大于菌絲體多糖。與EDTA二鈉相比，上述2種多糖的鐵離子螯合能力均較低，這可能是由于多糖是大分子物質(zhì)，對(duì)金屬離子的螯合能力受到其空間結(jié)構(gòu)等因素的影響。

圖4 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖的鐵離子螯合能力

2.5 平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖還原能力的比較

抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力就越強(qiáng)。因此，一種化合物的還原能力可以作為其潛在抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)[16]，可通過測(cè)定抗氧化劑的還原力來說明其抗氧化能力的大小。由圖5可知，2種多糖均具有還原能力，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的增加，其還原力也隨之增強(qiáng)。當(dāng)濃度為15 mg/mL時(shí)，它們的OD值最大，分別為0.653和1.012。菌絲體、發(fā)酵液多糖的EC50值分別為11.24 mg/mL和7.91 mg/mL，表明發(fā)酵液多糖的還原力大于菌絲體多糖。2種多糖與VC比較，還原能力較弱，這可能是多糖是大分子物質(zhì)，具有的還原性末端相對(duì)較少的緣故。

圖5平菇菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖多糖的還原力

3 討論與結(jié)論

食用菌多糖是食用菌中最重要的活性成分之一，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化等抗氧化活性，從而可起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用，因此食用菌多糖成為保健食品、藥品以及抗氧化劑開發(fā)的重要來源[17]。

目前，科學(xué)工作者對(duì)食用菌多糖清除DPPH、羥自由基能力的研究較多。如陶明煊等的研究結(jié)果顯示金頂側(cè)耳(Plurotuscitrinopileauts)、姬菇(Pleurotuscornucopiae)和毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)子實(shí)體粗多糖清除DPPH自由基的EC50值分別為14.51、15.36和15.02 mg/mL[5]，遠(yuǎn)大于本研究中平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖的EC50值；與呂國(guó)英等的研究結(jié)果相比，在10～15 mg/mL范圍內(nèi)，平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖對(duì)DPPH自由基的清除率遠(yuǎn)大于蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)無性型菌絲體的去離子水、乙醇和丙酮提取物[18]。而在清除羥自由基的研究中，雞油菌(Cantharelluscibarius)、變綠紅菇(Russulavirescens)、金頂側(cè)耳、姬菇和毛頭鬼傘子實(shí)體粗多糖的EC50值分別為1.12、1.21、2.45、2.60和2.59 mg/mL[4, 5]，均大于本研究中平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖的EC50值；曹向宇等測(cè)定了經(jīng)過DEAE-32 離子交換層析和Sephadex G100 凝膠過濾純化的平菇子實(shí)體多糖對(duì)羥自由基的清除率，結(jié)果顯示，其為0.5 mg/mL時(shí)，清除率就達(dá)到53.78%[6]，效果優(yōu)于本研究中的平菇粗多糖，這可能是由于純化后的多糖有效成分更多的緣故。祝子坪在研究桑黃菌(Phellinus igniarius)菌絲體、發(fā)酵液多糖對(duì)上述2種自由基清除的能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌絲體多糖清除DPPH自由基的能力大于發(fā)酵液多糖，而測(cè)定清除羥自由基的能力其結(jié)果正好相反[15]，顯示了與本研究相一致的結(jié)果。由此可以看出，平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖具有較強(qiáng)的DPPH自由基、羥自由基清除能力，且清除能力存在差異。

在有關(guān)食用菌多糖鐵離子螯合能力的報(bào)道中，美味牛肝菌(BoletusedulisBull)、松茸(Tricholomamatsutake)、雞油菌、變綠紅菇和蜜環(huán)菌(Armillariamellea)子實(shí)體多糖的EC50值分別為12.78、4.97、3.22、3.79和3.41 mg/mL[4, 19]。也有研究表明，經(jīng)純化的洋蕈(Agaricusbisporus)、巴西蘑菇(Agaricusbrasiliensis)、赤靈芝(Ganodermalucidum) 和桑黃菌(Phellinuslinteus)子實(shí)體多糖鐵離子螯合能力的EC50值分別為7.80、2.04、0.59和0.91 mg/mL[20]。與之相比較，平菇發(fā)酵液多糖的EC50值為3.32 mg/mL，具有較強(qiáng)的鐵離子螯合能力。本研究結(jié)果也表明，發(fā)酵液多糖的還原力大于菌絲體多糖，與前人的研究結(jié)果一致[15]。

已有的研究表明，食用菌多糖具有較好地還原能力，如純化后的洋蕈、巴西蘑菇、赤靈芝和桑黃菌子實(shí)體水溶性多糖還原力的EC50值分別為14.83、3.13、0.67和0.47 mg/mL[20]；雞油菌、變綠紅菇、蜜環(huán)菌和棕灰口蘑(Tricholomamyomyces)子實(shí)體水溶性粗多糖還原力的EC50值分別為4.08、3.02、1.05和1.37 mg/mL[4]。而本研究中平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖還原力的EC50值分別為11.24和7.91 mg/mL，說明平菇菌絲體多糖的還原能力較弱。

綜上可知，平菇菌絲體、發(fā)酵液多糖具有較好地抗氧化活性，但它們的抗氧化能力存在差異。菌絲體多糖清除DPPH自由基較強(qiáng)；發(fā)酵液多糖清除羥自由基的能力、鐵離子螯合能力以及還原力較強(qiáng)。在一定的濃度范圍內(nèi)，多糖的濃度增加其抗氧化能力也隨之增強(qiáng)，呈量效依賴關(guān)系。

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