陳 成， 邱明鴻， 馬云淑△， 陳 茹， 馬恒嬌， 黃婷婷(.云南中醫(yī)學(xué)院， 云南 昆明 650500； .昆明元正生物科技有限公司， 云南 昆明 650500)

疲勞是指由機(jī)體運(yùn)動(dòng)本身所引起的“機(jī)體生理過程不能續(xù)持其功能在特定水平和或不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”的機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降的現(xiàn)象[1]。主觀上出現(xiàn)疲乏無力等不適感，并導(dǎo)致工作效率的降低。隨著生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增大，疲勞越來越成為影響人們生活質(zhì)量的重要因素。因此，延緩疲勞的發(fā)生和促進(jìn)疲勞的恢復(fù)一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。

瑪咖(LePidiummeyenii，Maca)為十字花科(Cruciferae)獨(dú)行菜屬(LePidium)一年生草本植物[2]，原產(chǎn)于海拔3500～4500 m的南美安第斯山區(qū)，麗江和會(huì)澤兩地因地理環(huán)境與原產(chǎn)地相似，種植已獲得成功。瑪咖形似蘿卜的根莖，傳統(tǒng)上作為食物和草藥，用于增強(qiáng)體力、提高精力、調(diào)節(jié)免疫、改善性功能等[3-8]?，F(xiàn)代研究表明，瑪咖含有瑪咖生物堿、芥子油苷和異硫氰酸酯、甾醇及其衍生物和硫氫酸芐及氨基酸類、多糖類、無機(jī)元素等多種化學(xué)成分[9]。目前對(duì)瑪咖的研究與保健品開發(fā)方興未艾，國內(nèi)市場(chǎng)上大部分保健食品多采用瑪咖生粉作為原料，生粉有效成分含量有限，有必要對(duì)其去粗取精，減少服用量，增強(qiáng)其保健功能，這也是瑪咖類保健食品開發(fā)的關(guān)鍵問題之一，本實(shí)驗(yàn)采用麗江引種瑪咖為原料，在經(jīng)研究確定瑪咖醇水雙提取工藝的基礎(chǔ)上，以瑪咖生粉為對(duì)照，考察了瑪咖提取物對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響，為進(jìn)一步開發(fā)利用麗江瑪咖打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重(20±2)g，生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2008-24，批號(hào)：0016699。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于云南中醫(yī)學(xué)院完成。

1.2 儀器 ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；R 10023旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；L-550臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DFY-800搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；Sartorius BT 25s電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；DY 89-II型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)(山海醫(yī)療器械(集團(tuán))有限公司手術(shù)器械廠)；WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；秒表；溫度計(jì)；灌胃針頭，手術(shù)器械。

爬桿器具：自制，直徑1 cm，長(zhǎng)25 cm的玻璃棒，砂紙(120目)打磨后上端固定在木板上制成爬桿架，下端懸空，玻璃棒下端距離地面30 cm，地面鋪上2 cm左右的海綿以防止小鼠落下摔傷。

游泳箱：根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)程序和方法》要求自制，規(guī)格：505040 cm。

1.3 試藥 瑪咖(LePidiummeyenii，Maca，麗江)與瑪咖提取物(均由由昆明元正生物科技有限公司提供)；D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；蒽酮(AR，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20130725)；硫脲(AR，中國成都金山化工試劑廠四川，批號(hào)：20130605)；三氯乙酸(AR，上海山浦化工有限公司，批號(hào)：20130730)；濃硫酸(AR，云南揚(yáng)林工業(yè)開發(fā)區(qū)汕鎮(zhèn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20121221)；生理鹽水(昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：13022201)；無水乙醇(AR，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20130529)；鉛皮(購自漁具店)；5%的三氯乙酸配制：精確稱取5.0 g三氯乙酸，用蒸餾水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，即可；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：使用前先將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品至于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h，準(zhǔn)確稱取100.00 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；蒽酮試劑中含 0.05% 蒽酮，1% 硫脲，用72% 硫酸配制；蒽酮試劑的配制參照文獻(xiàn)[10]。

1.4 瑪咖提取物(醇水雙提物)的制備 瑪咖干燥藥材飲片，將其粉碎成粗粉，稱取粗粉1 kg，加10倍量80%的乙醇回流提取2 h，冷卻，過濾；殘?jiān)偌尤?倍量80%的乙醇回流提取1.5 h，冷卻，過濾，濾液與第1次濾液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上低溫(60℃)回收乙醇，蒸發(fā)至干，得醇提物浸膏；殘?jiān)偌尤?0倍量的水提取2 h，用紗布濾過，濾液經(jīng)3000 r/min離心15 min，上清液蒸發(fā)至干，得水提取浸膏。此法制得醇提物浸膏266.4 g，水提物浸膏70.4 g，將浸膏粉碎混合均勻，得總浸膏336.0 g，即1 g總浸膏相當(dāng)于2.98 g(約3 g)生藥。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥 將昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，對(duì)其爬桿能力進(jìn)行初篩后分為5組，即空白對(duì)照組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和瑪咖生藥粉組。連續(xù)灌胃給藥，提取物高、中、低劑量組分別給予提取物3 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于生藥9 g·kg-1·d-1)、2 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于生藥6 g·kg-1·d-1)和1 g·kg-1·d-1(相當(dāng)于生藥3 g·kg-1·d-1)，原藥粉組給予生藥粉末(過200目篩)3 g·kg-1·d-1，空白組給與等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)各組小鼠均自由攝食與飲水。

2.2 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn) 對(duì)小鼠進(jìn)行爬桿能力初篩后，棄去不爬桿的小鼠，篩選出爬桿時(shí)間相近的小鼠隨機(jī)分配到空白組、瑪咖提取物高、中、低組和原藥粉組，每組10只。給藥劑量按方法2.1進(jìn)行，連續(xù)灌胃15 d。末次灌胃給藥30 min后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠放到玻璃棒上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時(shí)間，第3次跌落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)3次的時(shí)間作為爬桿時(shí)間。

2.3 小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠游泳能力初篩 實(shí)驗(yàn)前預(yù)先對(duì)所有正常小鼠進(jìn)行力竭游泳篩選，尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，水深30 cm，水溫(25±0.5)℃，記錄小鼠自落水開始至鼻孔沉入水面下5 s不浮出水面的時(shí)間作為小鼠游泳時(shí)間，篩選出游泳時(shí)間相近的小鼠隨機(jī)分配到空白組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和原藥粉組，每組10只，給藥方式同方法2.1。

2.3.2 小鼠力竭游泳時(shí)間測(cè)定 各組小鼠喂飼到第15天，灌胃給藥30 min后，置于水溫(25.0±0.5)℃，水深30 cm的游泳箱中5%力竭游泳。為了防止互相擠靠，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每次放入小鼠5只，在實(shí)驗(yàn)過程中使每只小鼠四肢保持運(yùn)動(dòng)，如果小鼠漂浮在水面四肢不動(dòng)，用玻璃棒在其附近攪動(dòng)，促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)。以小鼠沉入水底，10 s不能浮出水面為溺死指標(biāo)，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間。

2.4 小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原的測(cè)定實(shí)驗(yàn)

2.4.1 葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支干凈的試管，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL于各試管中，再分別向各試管中加入1.9、1.8、1.7、1.6、1.5和1.4 mL蒸餾水，使各試管中液體的體積都等于2 mL，然后和實(shí)驗(yàn)組試管進(jìn)行同樣的操作，測(cè)其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得的吸光度分別為0.157、0.320、0.463、0.608、0.739和0.894。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 1.4534x + 0.0215，R2= 0.9992。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)與肝糖原測(cè)定方法 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按體重將其隨機(jī)分成5組：空白組、瑪咖提取物高、中、低劑量組和原藥粉組，每組10只。按照方法2.1給藥，連續(xù)給藥15天，于末次給藥后30 min，在溫度30℃的水箱中不力竭游泳90 min(每箱一次放入5只)，每次入水前均將水溫調(diào)至30 ℃，室溫恒定在 25 ℃。 游泳后立即處死取肝。參照文獻(xiàn)[10]測(cè)定肝糖原的含量。

3 結(jié)果

3.1 瑪咖提取物對(duì)小鼠爬桿時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瑪咖提取物低劑量組與空白對(duì)照組和瑪咖生藥粉組相比較，均能顯著延長(zhǎng)小鼠的爬桿時(shí)間(P<0.01)，說明低劑量的瑪咖提取物具有明顯的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用；而中劑量、高劑量和原藥粉組與空白組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 瑪咖提取物對(duì)小鼠爬桿時(shí)間的影響

3.2 瑪咖提取物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 游泳試驗(yàn)結(jié)果顯示，瑪咖提取物低劑量組能顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間(P<0.01)，而瑪咖生藥粉組與空白組比較，差異無顯著性意義。說明低劑量瑪咖提取物與瑪咖生藥粉相比，具有更好的抗疲勞作用。見表2。

表2 瑪咖提取物對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

3.3 瑪咖提取物對(duì)小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)后肝糖原含量的影響 結(jié)果見表3。

表3 瑪咖提取物對(duì)小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)后肝糖原含量的影響

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃瑪咖提取物低劑量組的小鼠爬桿時(shí)間顯著地高于生理鹽水組(P<0.01)，在力竭游泳試驗(yàn)中持續(xù)游泳時(shí)間也較生理鹽水組顯著增長(zhǎng)(P<0.01)，持續(xù)運(yùn)動(dòng)后肝糖原積累含量顯著高于生理鹽水組(P<0.05)。提示長(zhǎng)期服用適當(dāng)課題中的瑪咖提取物可提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)小鼠的持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，具有一定的緩解體力疲勞作用。并且瑪咖提取物低劑量組與瑪咖生藥粉組相比較，也能顯著延長(zhǎng)小鼠的爬桿時(shí)間(P<0.01)和力竭游泳時(shí)間(P<0.05)，說明，對(duì)麗江引種瑪咖按實(shí)驗(yàn)方法提取后，具有去粗取精、增加其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用。

本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，將實(shí)驗(yàn)各組小鼠(每組10只，共50只)繼續(xù)飼養(yǎng)到30天后，瑪咖生藥粉組小鼠體重(27.72±2.29)g和瑪咖提取物低劑量組小鼠體重(27.10±1.15)g顯著低于空白對(duì)照組(31.31±1.52)g(P<0.01)，而瑪咖提取物中劑量組小鼠體重(30.62±2.80)g和高劑量組的小鼠體重(32.91±3.17)g與空白對(duì)照組比較，三組之間的體重差異無顯著性意義。提示連續(xù)服用適量的瑪咖或者瑪咖提取物，有控制小鼠的體重的作用。也提示中、高劑量的瑪咖提取物抗疲勞作用不明顯，可能與小鼠體重增長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)有關(guān)。

機(jī)體產(chǎn)生疲勞的機(jī)制較為復(fù)雜[11]，主要包括能源物質(zhì)耗竭、疲勞物蓄積、自由基增多、中樞神經(jīng)系統(tǒng)工作能力下降、機(jī)體內(nèi)環(huán)境失調(diào)等。運(yùn)動(dòng)性疲勞可分為軀體性疲勞和心理性疲勞[12]。軀體性疲勞主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)能力下降，心理性疲勞主要表現(xiàn)為行為的改變。疲勞的評(píng)價(jià)方法主要有運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)和生化改變的檢測(cè)。運(yùn)動(dòng)耐力是反映機(jī)體疲勞最直接、最客觀的指標(biāo)。所謂抗疲勞，就是延緩疲勞的產(chǎn)生和/或加速疲勞的消除。運(yùn)動(dòng)耐力的測(cè)定方法有運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)、爬桿和游泳。運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)有滾筒式和平板式兩種，該裝置較貴，不便于推廣[10]。爬桿裝置簡(jiǎn)單，但有的小鼠并非因疲勞落地，而是由于其他主觀原因而放棄抓桿掉落下來的，并且因小鼠趾甲的抓損和桿的光潔度等因素很難保持一致，因此爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果個(gè)別組的標(biāo)準(zhǔn)偏差過大，不如游泳試驗(yàn)結(jié)果可靠。但爬桿實(shí)驗(yàn)側(cè)重于考察小鼠肌肉對(duì)靜態(tài)力的持久能力[13]。游泳試驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果能客觀地反映機(jī)體的體能，最為常用。

為了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)瑪咖提取物的抗疲勞作用，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原的含量，體內(nèi)的糖水平與運(yùn)動(dòng)時(shí)的耐力密切相關(guān)，增加肝糖原含量可以增強(qiáng)機(jī)體的抗疲勞能力，肝糖原含量是一個(gè)較敏感的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瑪咖提取物可促進(jìn)肝糖原的積累，提示瑪咖提取物可有效改善機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的壓力。

5 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)中以低劑量的瑪咖提取物所表現(xiàn)的抗疲勞作用最好，過高劑量反而無明顯抗疲勞作用，提示服用適當(dāng)劑量的瑪咖提取物會(huì)有良好的抗疲勞作用。因此，為了弄清瑪咖提取物抗疲勞作用的機(jī)理，還需要進(jìn)行深入的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

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