王藝淳 林新瑜王 芳 廖恒利 劉 偉 陳明懿

芍藥苷對(duì)人黑素細(xì)胞生物活性及遷移的影響

王藝淳 林新瑜?王 芳 廖恒利 劉 偉 陳明懿

目的: 確定芍藥苷對(duì)人黑素細(xì)胞生物活性及遷移的影響。方法: 體外培養(yǎng)人表皮黑素細(xì)胞,分別使用MTT法、L－DOPA法、NaOH法、Transwell小室法檢測(cè)不同濃度的芍藥苷對(duì)黑素細(xì)胞的增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成以及黑素細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果: 芍藥苷能顯著促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖和上調(diào)酪氨酸酶活性,且10 μg/mL是產(chǎn)生這兩方面作用的最佳濃度；芍藥苷也能促進(jìn)黑素的合成,50 μg/mL時(shí)作用最顯著。芍藥苷在20 μg/mL時(shí)顯著促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移。各組與空白對(duì)照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論: 芍藥苷單體可能是白芍中促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移的主要活性成分。

芍藥苷； 補(bǔ)骨脂素； 黑素細(xì)胞

白芍,毛茛科芍藥屬植物,高頻率出現(xiàn)在許多治療白癜風(fēng)和黃褐斑的方劑中,1具有良好的治療色素障礙性疾病的療效。芍藥苷(paeoniflorin,PF)作為白芍的主要單體,具有抗氧化及改善微循環(huán)等作用。2本文選取白芍的單體做實(shí)驗(yàn),相比成分復(fù)雜的原藥,更能準(zhǔn)確反應(yīng)其對(duì)黑素細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn),黑素細(xì)胞的遷移在白癜風(fēng)的色素恢復(fù)中起重要作用。3本文將芍藥苷作用于黑素細(xì)胞,觀察其遷移情況,并選取補(bǔ)骨脂素作為陽性對(duì)照,以期為治療色素障礙性疾病尋找安全、有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 黑素細(xì)胞來源于健康青少年包皮環(huán)切術(shù)后皮膚組織原代培養(yǎng)而來。芍藥苷、補(bǔ)骨脂素均購自成都市藥檢所；人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)基Medium254型,人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑－2,胎牛血清,胰酶等購自Gibco公司；左旋多巴(L－DOPA),噻唑藍(lán)(MTT),纖維連接蛋白均購自Sigma公司；分離酶II購自Roche公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶,Transwell小室均購自Corning公司；倒置相差顯微鏡DP72產(chǎn)自O(shè)lympus公司；全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀,CO2恒溫孵育箱均產(chǎn)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定方法參見文獻(xiàn),4鑒定采用左旋多巴染色和S－100蛋白免疫組化染色,4經(jīng)鑒定證實(shí)為黑素細(xì)胞后,取純化黑素細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 對(duì)黑素細(xì)胞生物活性的影響測(cè)定 將黑素細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。將芍藥苷、補(bǔ)骨脂素分別稀釋為2.5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL由低到高6個(gè)濃度梯度。分別加入上述96孔板中,每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照組(只加細(xì)胞和培養(yǎng)基)及無細(xì)胞組(只加培養(yǎng)基),以補(bǔ)骨脂素組為陽性對(duì)照。

黑素細(xì)胞增殖活性的測(cè)定:采用MTT法。按上述分組后96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱72 h,取出后每孔分別加入20 μL 1 mg/mL的MTT溶液。再繼續(xù)37℃培養(yǎng)4 h。每孔再加入二甲基亞砜150 μL,振蕩10 min后立即置于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸光度值。按以下公式計(jì)算:細(xì)胞增殖率＝(實(shí)驗(yàn)組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)/(空白對(duì)照組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)×100%。

黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測(cè)定:采用左旋多巴(L－Dopa)氧化速率法,按上述分組后96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱48 h,PBS液洗滌后每孔加入0.5%Triton－X溶液100 μL,迅速置于－80℃凍存30 min,取出后室溫融化。再每孔加入0.1%L－Dopa溶液,于37℃孵育3 h,置于酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值。按以下公式計(jì)算:酪氨酸酶活性＝(實(shí)驗(yàn)組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)/(空白對(duì)照組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)×100%。

黑素細(xì)胞黑素合成的測(cè)定:采用NaOH裂解法,細(xì)胞接種和設(shè)組同上,藥物分別作用細(xì)胞48 h后PBS液洗滌,每孔加入1 mol/L NaOH 100 μL,37℃水浴1 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)460 nm的吸光度值。按以下公式計(jì)算:黑素合成率＝(實(shí)驗(yàn)組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)/(空白對(duì)照組吸光度值－無細(xì)胞組吸光度值)×100%。

1.2.3 對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響測(cè)定 Transwell小室由直徑8.0 μm微孔的聚碳酸酯膜將細(xì)胞培養(yǎng)孔板分為上下兩室,先取出聚碳酸酯膜用纖維連接蛋白包被,過夜晾干。次日洗滌后,將小室放入預(yù)先每孔加500 μL的培養(yǎng)液的24孔板內(nèi),上室中加入純化黑素細(xì)胞100 μL,下室中分別加入藥物等。置37℃、5% CO2條件培養(yǎng)14 h后,取出上室,擦去其內(nèi)面(未遷移至膜下側(cè))的細(xì)胞。將聚碳酸酯膜用4%多聚甲醛固定30 min,蘇木精－伊紅(H－E)染色。梯度酒精脫水干燥。置顯微鏡下觀察,高倍鏡下(×40)隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞,所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

圖2 左旋多巴染色黑素細(xì)胞(×400)

圖3 S－100抗體染色黑素細(xì)胞(×400)

圖1 原代黑素細(xì)胞(×200)

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 原代黑素細(xì)胞大多胞體圓而小,胞漿透明,呈現(xiàn)2個(gè)對(duì)稱的突起；較少數(shù)細(xì)胞胞體大且呈多角形,其胞漿內(nèi)可見色素顆粒,有3個(gè)或3個(gè)以上的樹突(圖1)。經(jīng)左旋多巴染色鑒定,鏡下可見胞漿及樹突被染成灰棕色或棕褐色(圖2)。再經(jīng)S－100免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定鏡下見細(xì)胞胞漿內(nèi)著色,呈棕黃色或棕褐色(圖3)。以上兩種鑒定均表明染色結(jié)果為陽性,證實(shí)為黑素細(xì)胞。

2.2 芍藥苷對(duì)黑素細(xì)胞生物活性的影響 芍藥苷能促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖,且在較高濃度(100 μg/mL)時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用。細(xì)胞增殖率隨芍藥苷濃度升高而增強(qiáng),并于10 μg/mL時(shí)上升到最高。5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL濃度組的芍藥苷和補(bǔ)骨脂素均具有顯著的促細(xì)胞增殖能力,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL濃度組的芍藥苷顯示出上調(diào)酪氨酸酶的活性,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。并于10 μg/mL時(shí),促進(jìn)作用最強(qiáng)。5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL濃度組的補(bǔ)骨脂素亦顯示出上調(diào)酪氨酸酶的活性的作用,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

芍藥苷組在濃度為20 μg/mL、50 μg/mL時(shí)顯著的促進(jìn)黑素合成,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。50 μg/mL是芍藥苷組的最佳作用濃度。10 μg/mL、20 μg/mL濃度組的補(bǔ)骨脂素顯著促進(jìn)黑素合成,并于20 μg/mL濃度作用強(qiáng)度最佳。見表3。

表1 不同濃度的中藥單體組與空白對(duì)照組黑素細(xì)胞增殖活性的比較

表2 不同濃度的中藥單體組與空白對(duì)照組酪氨酸酶活性的比較

表3 不同濃度的中藥單體組與空白對(duì)照組黑素合成的比較

2.3 芍藥苷對(duì)黑素細(xì)胞遷移的影響 本次遷移的實(shí)驗(yàn)濃度選擇10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3組。測(cè)定結(jié)果如下(表4,圖4～8)。20 μg/mL的芍藥苷組具有顯著地促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移能力,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。補(bǔ)骨脂素組在10 μg/ mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3個(gè)濃度均顯著地促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移,與空白對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜ 0.05)。其中補(bǔ)骨脂素在濃度20 μg/mL時(shí)其作用強(qiáng)度最高(表4,圖9～11)。

表4 不同中藥單體組與空白對(duì)照組黑素細(xì)胞遷移的比較

圖4 無細(xì)胞組(HE,×40)

圖5 空白對(duì)照組(HE,×40)

圖6 10 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖7 20 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖8 50 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖9 10 μg/mL補(bǔ)骨脂素(HE,×40)

圖10 20 μg/mL補(bǔ)骨脂素(HE,×40)

圖11 50 μg/mL補(bǔ)骨脂素(HE,×40)

3 討論

中藥白芍在黃褐斑和白癜風(fēng)這兩種色素代謝相反的病種中均被廣泛使用。但這種中藥是通過何種機(jī)制作用于色素性疾病尚不清楚。目前許多關(guān)于白芍對(duì)酪氨酸酶活性影響的研究結(jié)果截然不同。既往研究顯示白芍對(duì)酪氨酸酶活性起促進(jìn)作用；涂彩霞等5研究發(fā)現(xiàn),白芍無明顯上調(diào)酪氨酸酶活性的作用；雷鐵池等6研究發(fā)現(xiàn)白芍對(duì)酪氨酸酶活性有高濃度抑制和低濃度激活的作用。以上文獻(xiàn)顯示不同提取方法及不同藥物濃度致其實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大,中藥成分較為復(fù)雜,而中藥單體的純度較高,作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象更科學(xué)。芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物,具有抗自由基損傷,抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其有降低血液黏度、改善微循環(huán)、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng),并且毒副作用較小。2本實(shí)驗(yàn)選擇白芍的主要單體芍藥苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn),并選取補(bǔ)骨脂素作為陽性對(duì)照,以作比較。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示芍藥苷能促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,并在較高濃度時(shí)細(xì)胞仍生長(zhǎng)較好,并能上調(diào)酪氨酸酶活性,且作用強(qiáng)度與補(bǔ)骨脂素相似,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。既往張美華等7觀察48味中藥對(duì)體外培養(yǎng)鼠黑素瘤細(xì)胞黑素形成的影響,發(fā)現(xiàn)白芍對(duì)黑素合成無明顯影響。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芍藥苷能促進(jìn)黑素的合成。另有李劍等8研究表明濃度為5～20 μg/mL的芍藥苷可促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,濃度為20 μg/mL的芍藥苷顯示出對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性和黑素合成均有上調(diào)的作用。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分相符。補(bǔ)骨脂作為臨床治療白癜風(fēng)的常用藥,其對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成的促進(jìn)作用已被許多實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。9,10本實(shí)驗(yàn)中作為陽性對(duì)照的補(bǔ)骨脂素在促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖,上調(diào)酪氨酸酶活性,促進(jìn)黑素合成方面均有顯著作用,與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符。本實(shí)驗(yàn)得出芍藥苷在一定濃度能促進(jìn)黑素細(xì)胞的生物活性,但未檢測(cè)出抑制黑素細(xì)胞生物活性的作用,猜測(cè)可能與藥物濃度的選擇有關(guān),今后可選擇多些濃度點(diǎn),進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)臨床觀察,在白癜風(fēng)治療起效初期,多數(shù)患者皮損在毛囊周圍先形成色素島,提示毛囊外毛根鞘中的黑素細(xì)胞遷移與色素島的形成密切相關(guān)。11Norris等12也指出黑素細(xì)胞的移行與黑素合成在白癜風(fēng)的復(fù)色過程中有同樣重要的作用。本研究使用Transwell小室檢測(cè)體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞遷移能力。Transwell小室,即遷移小室,是一種特殊的實(shí)驗(yàn)裝置。用具有通透性的聚碳酸酯膜將培養(yǎng)系統(tǒng)分隔為上室和下室,從而研究下室培養(yǎng)液中成分對(duì)上室內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)的影響。Transwell現(xiàn)已廣泛用于細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲等多方面的研究。13本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 20 μg/mL的芍藥苷組能顯著促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移。既往馬慧群等14研究顯示,補(bǔ)骨脂、白芷等可促進(jìn)黑素細(xì)胞遷移和黏附。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。綜合本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),我們認(rèn)為白芍的主要單體芍藥苷能在多方面促進(jìn)黑素細(xì)胞的生物學(xué)活性,并且在一定濃度時(shí)能促進(jìn)黑素細(xì)胞的遷移,由此推測(cè)白芍中影響黑素細(xì)胞的主要活性成分是芍藥苷單體。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥單體的提純提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為色素性疾病的治療提供新的思路。

1賈靜.中醫(yī)藥治療白癜風(fēng)的近況.中醫(yī)藥信息,2003,20(2):16－20.

2鄭世存,李曉宇,歐陽兵,等.芍藥苷藥理作用研究新進(jìn)展.中國藥物警戒,2012,9(2):100－103.

3 Yoshida H,Kunisada T,Grimm T,et al.Review:melanocyte migration and survival controlled by SCF/c－kit cxpression.J Invest Dermatol Symp Proc,2001,6(1):1－5.

4朱堅(jiān)勇,呂中法.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素－1體外協(xié)同培養(yǎng)正常人黑素細(xì)胞.中國皮膚性病學(xué)雜志,2011,25 (7):535－537.

5涂彩霞,劉之力,任鳳,等.47種中藥對(duì)酪氨酸酶活性的影響及酶動(dòng)力學(xué)的研究.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2006,6(22):456－458.

6雷鐵池,朱文元,夏明玉,等.89味中藥乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的上調(diào)作用.臨床皮膚科雜志,1999,28(3):147－149.

7張美華,朱文元.48味中藥對(duì)體外培養(yǎng)鼠黑素瘤細(xì)胞黑素形成的影響.江西中醫(yī)藥,1999,20(5):44－46.

8李劍,傅雯雯,張勇,等.中藥單體芍藥甙促進(jìn)黑素合成的機(jī)制研究.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2009,25(9):657－659.

9牟寬厚,張憲旗,余兵,等.補(bǔ)骨脂對(duì)體外黑素細(xì)胞黏附和遷移的作用.中國中藥雜志,2004,4(29):346－349.

10王鷹,李海東,孫仁美,等.補(bǔ)骨脂對(duì)SCF/Kit/MITF信號(hào)通路的調(diào)控作用.中國皮膚性病學(xué)雜志,2011,9(25):657－660.

11 Zheng J,Jin S,Shi R,et al.Confirmation of PSORS psoriasis susceptibility loci in a Chinese population.Arch Dermatol Res, 2003,295(1):14－18.

12 Norris A,Todd C,Graham A,et al.The expression of the ckit receptor by epidermal melanocytes may be reduced in vitiligo.Br J Dermatol,1996,134(2):299－306.

13周云飛,張愛華,劉文虎,等.Transwell模擬生物屏障.北京生物醫(yī)學(xué)工程,2009,6(28):657－660.

14馬慧群,張憲旗,牟寬厚,等.單味中藥對(duì)黑素細(xì)胞黏附和遷移的影響.中國皮膚性病學(xué)雜志,2004,18(9):526－527.

(收稿:2014－03－26 修回:2014－06－03)

Effects of paeoniflorin on biological activity and migration of human melanocytes

WANG Yi-chun,LIN Xin-yu,WANG Fang,et al.Department of Dermatology,Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu,610072

Objective:To determine the effects of paeoniflorin on biological activities and migration of melanocytes.Methods:A melanocytes culture system was established and proliferation activity,tyrosinase activity,melanogenesis and migration were detected by MTT,L－DOPA,NaOH method and transwell assay respectively.Results:The paeoniflorin improved the melanocytes proliferation and tyrosinase activity,in which the effects were the most obvious at the concentration of 10 μg/mL.The paeoniflorin promoted the synthesis of melanin,which was the most obvious at the concentration of 50 μg/mL.Paeoniflorin promoted the migration of melanocytes obviously at the concentration of 20 μg/mL.There were significant differences between the paeoniflorin groups and the control groups(P＜0.05).Conclusion:The paeoniflorin is the principal active component of radix paeoniae alba that promoting the migration of melanocytes.

paeoniflorin；psoralen；melanocytes

四川省衛(wèi)生廳資助課題(編號(hào):110219)

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所,四川成都,610072

?通信作者