李晉南 徐奇友 王常安 羅 亮 趙志剛

近年來，谷氨酰胺(glutamine，Gln)因其獨(dú)特的生理功能逐漸成為營養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的研究熱點(diǎn)。研究表明，Gln可以增加免疫功能、維持酸堿平衡、增加細(xì)胞體積和增強(qiáng)肌肉細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成等［1］。在許多物種中，腸黏膜和其他迅速增生的細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)的主要能量來源是Gln，而非葡萄糖。因此，腸道是Gln最主要的消耗器官［2］，但腸黏膜本身既不能產(chǎn)生也無法儲(chǔ)存Gln，因此適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充Gln可以增加腸絨毛高度、降低腸黏膜通透性和增強(qiáng)腸免疫功能［3］。然而，Gln在水溶液中極不穩(wěn)定，受熱易分解成有毒的焦谷氨酸和氨，從而限制了它的使用。因此，本研究選擇 α－酮戊二酸(α-ketoglutarate，AKG)、鳥氨 酸 － α － 酮 戊 二 酸 (ornithine-α-ketoglutarate，OKG)和谷氨酸(glutamate，Glu)3種 Gln的前體物，研究它們對松浦鏡鯉腸道消化酶活性及腸道形態(tài)的影響，旨在探討Gln前體物替代Gln的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

AKG 和 Glu購自 Sigma，純度≥98.5%;Gln購自哈爾濱百事達(dá)生物公司;OKG購自溧陽市開拓者化學(xué)技術(shù)服務(wù)中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧

試驗(yàn)選擇規(guī)格一致的初始體重為(97.33±6.74)g的健康松浦鏡鯉(選自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所)270尾。預(yù)試2周后隨機(jī)分為6組，4個(gè)試驗(yàn)組分別為AKG組、OKG組、Gln組、Glu組，同時(shí)以魚粉(FM)組和植物蛋白質(zhì)(PM)組為對照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚。試驗(yàn)期為60 d。

FM組以魚粉和豆粕為蛋白質(zhì)源，PM組以豆粕代替魚粉為蛋白質(zhì)源，同時(shí)用L－蛋氨酸、賴氨酸和L－蘇氨酸調(diào)節(jié)氨基酸平衡，魚油和豆油為脂肪源，羧甲基纖維素為黏合劑，配制成等氮等能飼料。各試驗(yàn)組在植物蛋白質(zhì)飼料基礎(chǔ)上分別添加1.5%AKG、OKG、Gln 和 Glu。具體飼料組成及營養(yǎng)水平見參考文獻(xiàn)［4］。飼料原料經(jīng)粉碎按配比混合均勻，少量的組分采用逐級擴(kuò)大法混合，然后用顆粒機(jī)制成2 mm顆粒飼料，置于－20℃冰箱中保存待用。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間每天定時(shí)投喂3次，每次投喂以飽食無殘餌為準(zhǔn)。試驗(yàn)在室內(nèi)控溫循環(huán)水族箱里進(jìn)行，溫度為(24±1)℃，24 h不間斷供氧，溶氧大于5 mg/L，每日吸污，每周換去水族箱內(nèi)2/3水并注入已曝氣的水，每日觀察記錄魚攝食和死亡情況。

1.4 腸道消化酶活性的測定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，每缸隨機(jī)選取3尾魚，置于冰盤中迅速解剖，分別取前腸、中腸和后腸，用冰浴的0.86%生理鹽水洗凈腸道中的內(nèi)容物，濾紙吸干水分，測量腸重。按1∶9質(zhì)量體積比加入生理鹽水，以FJ－200CL高速組織勻漿機(jī)勻漿，4℃條件下4 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中，－20℃保存待測蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。

蛋白酶活性測定采用福林－酚(Folin-phenol)法，以0.5%酪素作底物，將1 mL酶粗提液(對照管為1 mL去離子水)在37℃預(yù)熱5 min后，加入2 mL預(yù)熱的0.5%酪素，37℃反應(yīng)15 min，然后加入10%三氯乙酸3 mL，終止反應(yīng)，離心取上清液1 mL加入 0.55 mol/L Na2CO35 mL，再加1 mL福林－酚試劑，在37℃水浴中顯色15 min，680 nm波長下比色，以對照管調(diào)零，測吸光度。用同樣的方法計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸－吸光度的回歸方程，運(yùn)用回歸方程計(jì)算經(jīng)酶分解酪素所產(chǎn)生的酪氨酸的量(μg)。蛋白酶活性單位定義:在37℃下，每分鐘水解酪素產(chǎn)生相當(dāng)于1μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活性單位。

淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體方法參見試劑盒說明書。淀粉酶活性單位定義:在37℃下，組織中每毫克蛋白質(zhì)與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)酶活性單位。脂肪酶活性單位定義:在37℃下，每克組織蛋白質(zhì)在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1μmol底物為1個(gè)酶活性單位。

1.5 腸道形態(tài)的測定

腸道組織切片的制備:飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3尾魚，置于冰盤中迅速解剖，分別取前腸、中腸和后腸，以0.86%的生理鹽水沖洗干凈，固定于Bouin氏液中。固定24 h后，經(jīng)過乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片(5μm)、蘇木精－伊紅(HE)染色、脫水、透明、中性樹脂封片。用LeicaMD 4000B顯微鏡觀察并拍照，圖像由Motic Images Plus 2.0軟件進(jìn)行測量，每段腸樣測量15個(gè)以上完整皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度，分別取其平均值作為該樣品各指標(biāo)的測定結(jié)果。

腸道指標(biāo)的計(jì)算方法:飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3尾魚，測量試驗(yàn)魚體重、體長、腸重和腸長，計(jì)算腸體指數(shù)(intestinal somatic index，ISI)、腸長指數(shù)(intestinal length index，ILI)。

腸體指數(shù)(%)=(腸重/體重)×100;

腸長指數(shù)(%)=(腸長/體長)×100。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan氏法多重比較，顯著性水平P值為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響

由表1可知，各組間前腸和中腸的蛋白酶活性沒有顯著差異(P＞0.05);Glu組后腸的蛋白酶活性顯著低于 FM 組(P＜0.05)。OKG組和 Gln組前腸的淀粉酶活性顯著高于FM組和PM組(P＜0.05);Glu組中腸的淀粉酶活性顯著低于FM組、PM 組和 Gln 組(P＜0.05);同樣，Glu 組后腸的淀粉酶活性最低，且顯著低于AKG組和FM組(P＜0.05)。各組間中腸和后腸的脂肪酶活性沒有顯著差異(P＞0.05);Glu組前腸的脂肪酶活性顯著高于 Gln組、OKG組、FM 組和 PM 組(P＜0.05);AKG組前腸的脂肪酶活性顯著高于FM組和 OKG 組(P＜0.05)。

表1 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道消化酶活性的影響Table 1 Effects of Gln and its precursors on intestinal digestive enzyme activity of Songpu mirror carp U/g prot

2.2 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

由表2可知，各組間腸長指數(shù)沒有顯著差異(P＞0.05)。AKG 組、Gln 組、Glu 組及 PM 組的腸體指數(shù)顯著高于FM 組(P＜0.05)，OKG組的腸體指數(shù)與FM組差異不顯著(P＞0.05)。各組間中腸和后腸的皺襞高度沒有顯著差異(P＞0.05)，Gln組前腸的皺襞高度顯著低于AKG組、PM組和FM組(P＜0.05)。各組間各腸段的腸絨毛寬度差異不顯著(P＞0.05)。各組間前腸和后腸的肌層厚度差異不顯著(P＞0.05)，AKG組的中腸肌層厚度顯著高于FM 組(P＜0.05)，其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。

各組前腸組織切片如圖1所示，AKG組的腸絨毛發(fā)育良好，排列整齊緊密，因此增加了腸道的吸收面積，也有利于腸道的健康。Gln組的前腸腸絨毛排列緊密，密度比FM組有所增加，但皺襞高度下降，OKG組和Glu組前腸腸絨毛密度與FM組沒有明顯差異。

3 討論

Gln具有重要的生理作用，尤其是在腸道組織，但其在溶液中和某些生理狀態(tài)下不穩(wěn)定，且在臨床中很難掌握［5－6］。為了避免這些問題，我們選取AKG、OKG和 Glu等 Gln的前體物。AKG和Gln都是三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物，AKG通過轉(zhuǎn)氨作用生成Glu，Glu再進(jìn)一步形成Gln，這種轉(zhuǎn)化是非常快速的。因AKG在生理狀態(tài)和溶液中很穩(wěn)定且是無毒的，因此更適于替代Gln［6］。Glu穩(wěn)定性雖然好，但是有神經(jīng)毒性，能導(dǎo)致“中國餐館綜合征”，并且不易通過細(xì)胞膜［7］。OKG是由1分子的AKG和2分子的鳥氨酸組成，研究表明OKG能阻止肌肉中Gln的減少，增加蛋白質(zhì)的合成代謝，減少肌肉消耗［8］。

腸道是魚類營養(yǎng)消化吸收的重要場所，因此腸道的重量、腸道的皺襞高度和各消化酶活性與動(dòng)物體的生長發(fā)育和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有重要的關(guān)系。以往的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加Gln可以促進(jìn)陸生動(dòng)物腸道發(fā)育和提高消化酶活性［9－13］。在水生動(dòng)物的研究中，同樣表明添加Gln可以改善生長性能、腸道發(fā)育和免疫力［14－16］。Lin 等［17］發(fā)現(xiàn)飼料中添加Gln可以增加建鯉幼魚體增重、攝食量、腸道重量、腸絨毛高度、堿性磷酸酶和鈉鉀ATP酶活性。本試驗(yàn)的FM組飼料組成中魚粉20%，豆粕34%，粗蛋白質(zhì)30.71%，PM 組飼料組成中豆粕62%，粗蛋白質(zhì)30.81%，各試驗(yàn)組在PM組基礎(chǔ)上分別添加1.5%的Gln及其前體物［4］。本試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，添加Gln前體物AKG組、Glu組和Gln組的腸體指數(shù)比FM組有顯著的提高，但與PM組相比差異不顯著，這一結(jié)果可能是由于基礎(chǔ)飼料的不同而引起的。但是本試驗(yàn)的結(jié)果顯示它們并沒有顯著的增加腸絨毛高度，這一結(jié)果與徐奇友等［16］研究的Gln對虹鱒稚魚腸道形態(tài)的影響結(jié)果一致，其研究表明在12周時(shí)，添加1.0%和2.0%Gln顯著降低了虹鱒稚魚腸道的皺襞高度。其原因可能是由于Gln的不穩(wěn)定性，在配制飼料的過程中或其他不穩(wěn)定的情況下，如水溶液中，會(huì)產(chǎn)生有毒的焦谷氨酸和氨，本試驗(yàn)結(jié)果從皺襞高度和切片結(jié)果都可以看出，腸絨毛發(fā)育受到了抑制，其原因可能是由于添加的Gln沒有發(fā)揮作用，反而起到了抑制作用。因此限制了Gln在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。AKG組前腸的皺襞高度與對照組相比差異不顯著，且從切片中可以看出，AKG組腸絨毛致密程度增加，細(xì)長且排列整齊，這樣可以增加腸道的吸收面積，AKG組中腸的肌層厚度顯著高于FM組，肌肉層的環(huán)肌層部分對腸的蠕動(dòng)較為有利，AKG組肌層厚度增加在一定程度上促進(jìn)了腸道的蠕動(dòng)，提高了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。在之前的研究表明，AKG組的增重率和蛋白質(zhì)沉積效率分別比 PM組提高 5.96%和16.89%，AKG組試驗(yàn)動(dòng)物的生長性能略優(yōu)于其他添加組［4］，AKG組腸道結(jié)構(gòu)的改善可以解釋這一現(xiàn)象。

表2 Gln及其前體物對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Table 2 Effects of Gln and its precursors on intestinal morphology of Songpu mirror carp

圖1 松浦鏡鯉前腸組織切片F(xiàn)ig.1 Tissue slice of foregut of Songpu mirror carp

Lin等［17］等對建鯉幼魚的研究也表明，魚腸道蛋白酶和脂肪酶活性隨飼料Gln添加量上升而提高。而高進(jìn)等［18］的研究表明，飼料中添加Gln對大黃魚稚魚消化酶活性沒有顯著影響。徐奇友等［19］的研究表明，飼料中添加 0.25%～1.00%Ala-Gln顯著提高哲羅魚仔魚的腸脂肪酶活性。本研究的結(jié)果顯示，添加1.5%的OKG和Gln顯著提高了前腸的淀粉酶活性，Glu和AKG顯著提高了前腸的脂肪酶活性。這一結(jié)果說明Gln及其前體物可以顯著改善鯉魚前腸消化酶活性。

4 結(jié)論

Gln及其前體物可以顯著改善松浦鏡鯉前腸淀粉酶和脂肪酶活性。

［1］ YOUNG V R，AJAMI A M.Glutamate:an amino acid of particular distinction［J］.The Journal of Nutrition，2000，130:892S－900S.

［2］ YOUNG V R，AJAMI A M.Glutamine:the emperor or his clothes［J］.The Journal of Nutrition，2001，131(Suppl.9):2449S－2459S.

［3］ 任國譜，谷文英.谷氨酰胺活性肽營養(yǎng)液對大鼠小腸營養(yǎng)作用的研究［J］.氨基酸和生物資源，2003，25(4):40－42.

［4］ 李晉南，徐奇友，位瑩瑩，等.谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉生長性能、體成分和血清生化指標(biāo)的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44(12):119－125.

［5］ SMITH R J，WILMORE D W.Glutamine nutrition and requirements［J］.Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，1990，14(Suppl.4):94s－99s.

［6］ PIERZYNOWSKI S G，SJODIN A.Perspectives of glutamine and its derivatives as feed additives for farm animals［J］.Journal of Animal and Feed Sciences，1998(7):79－91.

［7］ 王鳳英，姚剛，李慧顯.谷氨酰胺(Gln)及其衍生物在小腸中的作用［J］.新疆畜牧業(yè)，2004(1):61－63.

［8］ CYNOBER L.Ornithine alpha-ketoglutarate in nutritional support［J］.Nutrition，1991，7(5):313－322.

［9］ 張軍民，高振川，王連娣，等.日糧添加谷氨酰胺對早期斷奶仔豬小腸酶的影響［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2001，13(4):18－23.

［10］ HELTON W S，JACOBS D O，BONNER-WEIR S，et al.Effects of glutamine-enriched parenteral nutrition on the exocrine pancreas［J］.Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，1990，14(4):344－352.

［11］ HELTON W S，SMITH R J，ROUNDS J，et al.Glutamine prevents pancreatic atrophy and fatty liver during elemental feeding［J］.Journal of Surgical Research，1990，48(4):297－303.

［12］ WU G，MEIER S A，KNABE D A.Dietary glutamine supplementation prevents jejunal atrophy in weaned pigs［J］.The Journal of Nutrition，1996，126(10):2578－2584.

［13］ MURNIN M，KUMAR A，LI G D，et al.Effects of glutamine isomers on human(Caco-2)intestinal epithelial proliferation，strain-responsiveness，and differentiation［J］.Journal of Gastrointestinal Surgery，2000，4(4):435－442.

［14］ 葉元土，王永玲，蔡春芳，等.谷氨酰胺對草魚腸道L－亮氨酸、L－脯氨酸吸收及腸道蛋白質(zhì)合成的影響［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2007，19(1):28－32.

［15］ 徐奇友，王常安，許紅，等.丙氨酰－谷氨酰胺對哲羅魚仔魚生長和抗氧化能力的影響［J］.動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009(6):1012－1017.

［16］ 徐奇友，王常安，許紅，等.外源性谷氨酰胺對虹鱒稚魚生長和腸道形態(tài)的影響［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2009，24(4):98－102.

［17］ LIN Y，QIU Z X.Dietary glutamine supplementation improves structure and function of intestine of juvenile Jian carp(Cyprinus carpiovar.Jian)［J］.Aquaculture，2006，256(1/2/3/4):389－394.

［18］ 高進(jìn)，艾慶輝，麥康森.微顆粒飼料中添加谷氨酰胺對大黃魚稚魚生長、存活及消化酶活力的影響［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，40(1):49－54.

［19］ 徐奇友，王常安，許紅，等.飼料中添加谷氨酰胺二肽對哲羅魚仔魚腸道抗氧化活性及消化吸收能力的影響［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2010，17(2):351－356.