黃勛和，林雅媚，李威娜，姚瓊鳳，鐘福生

(嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州514015)

五華三黃雞是優(yōu)良的小型肉用地方品種，主要分布于廣東省梅州市五華縣中部和北部.該品種具有悠久的歷史，長(zhǎng)期以來(lái)在獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境條件下自然選擇形成了獨(dú)特的生物學(xué)特性.在《中國(guó)禽類遺傳資源》記載的7種廣東省地方雞種中，五華三黃雞位列其中，也是粵北地區(qū)唯一入選的地方雞［1］.1964～1982年五華三黃雞一直是作為商品出口香港等地.1983年后，五華三黃雞受到改良商品雞“石岐雜”大量引入的沖擊，飼養(yǎng)數(shù)量急劇下降、品種特性受到嚴(yán)重侵蝕.同時(shí)，由于該雞種生長(zhǎng)速度慢、繁殖性能低，五華三黃雞未能得到足夠重視，品種保護(hù)意識(shí)薄弱，飼養(yǎng)規(guī)模小而分散［2］.目前五華縣大部分地區(qū)已被外來(lái)品種所取代，如胡須雞、麻雞、石岐雜雞等.現(xiàn)在品種純正的五華三黃雞數(shù)量已經(jīng)很少，主要分布在五華縣的邊遠(yuǎn)山區(qū)，作為散養(yǎng)家雞自給自足.因此，保護(hù)瀕危的地方特性品種五華三黃雞刻不容緩.

線粒體DNA控制區(qū)(mtDNA Control Region，D－loop)是非編碼基因區(qū)，在進(jìn)化過(guò)程中受環(huán)境的選擇壓力小，具有進(jìn)化速率快和母系遺傳的特點(diǎn)，常被用于探討鳥(niǎo)類的起源與分類問(wèn)題［3～8］.國(guó)內(nèi)外對(duì)五華三黃雞線粒體D－loop區(qū)的研究還未見(jiàn)報(bào)道.本研究通過(guò)比較五華三黃雞兩個(gè)類群與其他品種的mtDNA控制區(qū)D－loop的序列變異，分析它們的親緣關(guān)系，為五華三黃雞的保種選育提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的13只五華三黃雞取自梅州市豐華有機(jī)農(nóng)業(yè)發(fā)展公司種禽場(chǎng).采用拔取背部羽毛的方法，置于95%酒精－70℃保存?zhèn)溆?采用改良的方法提取羽毛基因組，－20℃保存?zhèn)溆茫?］.

1.2 PCR反應(yīng)及測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物為:PHDL(5＇－AGGACTACGGCTTGAAAAGC－3＇)和PHDH(5＇－CATCTTGGCATCTTCAGTGCC－3＇)［10］.反應(yīng)體系為:1×PCR Buffer(10 mmol/L Tris－HCl pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2)，4 μL dNTP混合物(各2.5 mmol/L)，1 μL連接產(chǎn)物，上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，2 U rTaq(TaKaRa)，補(bǔ)足ddH2O至50 μL.PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性4 min;94℃30 s，50℃50 s，72℃90 s，40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min，4℃ 保存.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AXYGEN AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化后，由上海立菲生物技術(shù)公司廣州測(cè)序部完成測(cè)序.

1.3 序列分析

先利用Bioedit軟件對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行編輯，然后用ClustalX進(jìn)行對(duì)位排列，經(jīng)人工仔細(xì)核查后，再利用DnaSP 4.0提取變異位點(diǎn).其他相關(guān)雞種的D－loop全長(zhǎng)序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).采用DNAMAN進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 5.0統(tǒng)計(jì)堿基組成，并計(jì)算基于Kimura雙參數(shù)模型的遺傳距離.以原雞為外群(GenBank登錄號(hào): AP003322)，構(gòu)建NJ分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D－loop區(qū)序列變異

用Bioedit和ClustalX對(duì)原始DNA序列進(jìn)行對(duì)位排列和剪切對(duì)齊后，得到五華三黃雞兩個(gè)類群——豐華和太和mtDNA控制區(qū)序列全長(zhǎng)分別為1232、1231bp.與原雞 (Gallusgallusgallus－AP003322)相比，發(fā)現(xiàn)其與五華三黃雞的豐華類群mtDNA D－loop區(qū)序列之間共有14個(gè)變異位點(diǎn)，都是堿基轉(zhuǎn)換，包括6次A－G間轉(zhuǎn)換和8次T－C間轉(zhuǎn)換;而五華三黃雞的太和類群mtDNA D－loop區(qū)全序列在第859位點(diǎn)缺失，與原雞mtDNA D－loop區(qū)序列之間共有14個(gè)變異位點(diǎn)，其中有一個(gè)是缺失，其他的變異位點(diǎn)都是堿基轉(zhuǎn)換，包括5次A－G間轉(zhuǎn)換和8次T－C間轉(zhuǎn)換(圖1).

2.2 mtDNA D－loop區(qū)堿基組成

本試驗(yàn)測(cè)定了五華三黃雞的兩種類群雞——豐華和太和的mtDNA控制區(qū)D－Loop全序列，其長(zhǎng)度分布為1232和1231 bp，堿基含量見(jiàn)表1.其中(A+T)含量60.3%～60.4%，明顯高于(G+C)含量39.6%.

表1 五華三黃雞D－loop序列堿基組成表

2.3 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

通過(guò)MEGA5.0軟件，采用鄰接法重建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，對(duì)五華三黃雞mtDNA D－loop基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析(圖2).結(jié)果表明，五華三黃雞兩個(gè)類群－－豐華和太和處于一個(gè)分支中，親緣關(guān)系非常近.基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算豐華和太和的遺傳距離為0.001，其中豐華類群與原雞的遺傳距離為0.012，而太和類群與原雞的遺傳距離為0.011.由圖1可以清晰的看出，五華三黃雞與原雞來(lái)自于一個(gè)大分支，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)紅原雞的親緣關(guān)系最近.

圖2 基于mtDNA D－loop序列的20種禽類NJ分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)PCR反應(yīng)和測(cè)序獲得了五華三黃雞的線粒體控制區(qū)D－loop全序列1231 bp和1232 bp，共發(fā)現(xiàn)14個(gè)變異位點(diǎn)，其中豐華類群都是堿基轉(zhuǎn)換，而太和類群有一個(gè)堿基缺失.A+T含量(＞60%)明顯大于G+C含量(＜40%)，這也是其他禽類mtDNA D－loop的一個(gè)明顯特征［11～12］.系統(tǒng)進(jìn)化分析表明五華三黃雞與中國(guó)紅原雞親緣關(guān)系較近;與轱轆雞親緣關(guān)系較遠(yuǎn);與泰國(guó)紅原雞和騰沖雪雞親緣關(guān)系最遠(yuǎn).其中太和類群與中國(guó)紅原雞的線粒體控制區(qū)序列同源性高達(dá)100.0%，說(shuō)明中國(guó)紅原雞可能是五華三黃雞的祖先.鳥(niǎo)類mtDNA控制區(qū)的進(jìn)化速度是2%/ Ma［13］，五華三黃雞豐華類群與原雞全序列計(jì)算的遺傳距離(0.012)，它們分歧進(jìn)化的時(shí)間約為60萬(wàn)年;五華三黃雞豐華類群與泰國(guó)紅原雞全序列計(jì)算的遺傳距離(0.013)，它們分歧進(jìn)化的時(shí)間約為65萬(wàn)年.

地方雞經(jīng)由貿(mào)易網(wǎng)絡(luò)、人類遷移和農(nóng)業(yè)擴(kuò)張而遍布全世界，同時(shí)也帶去了它們的基因遺產(chǎn)［8］.長(zhǎng)期與環(huán)境的共進(jìn)化以及人工選擇，形成了大量各具特色的地方品種.有些品種的歷史只有幾十年，而有些品種則達(dá)幾千年，如烏骨雞和杜金雞.Razafindraibe等(2008)［14］發(fā)現(xiàn)馬達(dá)加斯加島鄉(xiāng)村雞的一個(gè)單倍群可能來(lái)自商品雞品系的基因滲透.6個(gè)匈牙利地方雞的線粒體D－loop分析表明主要來(lái)源于印度次大陸，部分可能來(lái)源于東南亞、中國(guó)和日本［15］.宋春紅等(2007)［16］探討了中國(guó)6個(gè)地方雞品種的母系起源，推測(cè)這些品種分別來(lái)自云南、老撾和越南附近地區(qū)的紅原雞大陸亞種，基因流是品種群體間遺傳分化的主要因素.

五華三黃雞原產(chǎn)地五華縣，在秦漢時(shí)期隸屬于龍川縣，于北宋熙寧四年(1071)建縣(長(zhǎng)樂(lè)縣).明宋期間，大量客家先民遷至現(xiàn)在的梅州各縣后逐漸定居下來(lái).在此之前，現(xiàn)今五華縣轄區(qū)內(nèi)曾先后生活著“百越”、瑤、畬等土著民族，他們?cè)?jīng)是這片土地的主人［17］.本研究初步表明在進(jìn)化關(guān)系上五華三黃雞與中國(guó)紅原雞親緣關(guān)系較近，但五華三黃雞是否起源于中原地區(qū)，或是本地雞種，抑或是融合了中原的混合雞種，與客家其他地區(qū)如江西、福建等地方雞的親緣關(guān)系等科學(xué)問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究.

［1］陳國(guó)宏，王克華，王金玉.中國(guó)禽類遺傳資源［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004.

［2］鐘福生，黃勛和，周彩云，等.五華三黃雞山地放養(yǎng)條件下肉用性能及內(nèi)品質(zhì)的研究［J］.嘉應(yīng)學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)，2013，31(5):67－72.

［3］黃族豪，劉迺發(fā)，龍進(jìn).從線粒體DNA控制區(qū)基因比較石雞和大石雞的遺傳變異［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3):420－424.

［4］廖承紅，王華偉，梁浩，等.文昌雞線粒體DNA控制區(qū)序列遺傳多樣性分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(12):145－147.

［5］郭亮，張娟，馬建寧，等.固原雞線粒體DNA控制區(qū)全序列測(cè)定及分析［J］.中國(guó)家禽，2012，34(1):32－35.

［6］王文濤，陳彬，傅筑蔭.兩種貴州地方雞線粒體DNA控制區(qū)全序列分析［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(15):3114－3119.

［7］BERTHOULY－SALAZAR C，ROGNON X，NHU VAN T，et al.Vietnamese chickens:a gate towards Asian genetic diversity［J］.BMC Genet，2010(11):53.

［8］MWACHARO J M，BJORNSTAD G，MOBEGI V，et al.Mitochondrial DNA reveals multiple introductions of domestic chicken in East Africa［J］.Mol Phylogenet Evol，2011，58(2):374－382.

［9］陳美，黃勛和，王參謀，等.黃嘴白鷺遺傳多樣性AFLP分析方法的建立［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，47 (增刊2):6－10.

［10］FUMIHITO A，MITAKE T，TAKADA M，et al.The genetic link between the Chinese bamboo partridge(Bambusicola thoracica)and the chicken and junglefowls of the genus Gallus［J］.Proc Natl Acad Sci USA.1995，92(24): 11053－11056.

［11］李慧芳，朱文奇，楊寧，等.家鴨、媒鴨和野鴨mtDNA D－oop區(qū)的遺傳變異［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(9):213－219.

［12］張湯杰，李慧芳，陳寬維，等.利用線粒體D－loop區(qū)分析家鴨品種遺傳多態(tài)性與系統(tǒng)進(jìn)化［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(11):1168－1175.

［13］劉益平，朱慶，曾凡同，等.原雞線粒體DNA部分序列多態(tài)性分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35(2):134－140.

［14］RAZAFINDRAIBE H，MOBEGI V A，OMMEH S C，et al.Mitochondrial DNA origin of indigenous Malagasy chicken: implications for a functional polymorphism at the Mx gene［J］.Ann NY Acad Sci，2008(1149):77－79.

［15］REVAY T，BODZSAR N，MOBEGI V E，et al.Origin of Hungarian indigenous chicken breeds inferred from mitochondrial DNA D－loop sequences［J］.Anim Genet，2010，41(5):548－50.

［16］宋春紅，陳紅菊，馬月輝，等.中國(guó)6個(gè)地方雞品種的母系起源［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38(7):735－740.

［17］劉佐泉.客家歷史與傳統(tǒng)文化［M］.鄭州:河南大學(xué)出版社，2003.