張 麗，賈雄飛，牛 華，鄭 瑞，張望龍，毛小琴

(1 昆明理工大學(xué)，昆明 650500;2 中國人民解放軍昆明總醫(yī)院;3 云南省第一人民醫(yī)院)

有活性的蛋白激酶C受體1(RACK1)屬于Trp-Asp 40(WD-40)重復(fù)蛋白家族，其蛋白序列與G蛋白β亞單位具有高度同源性，并在所有真核細胞中高度保守［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)RACK1蛋白在R-普萘洛爾和S-普萘洛爾處理的藥效學(xué)細胞模型上存在明顯的表達差異［2］，推測其可能與普萘洛爾抗心律失常藥理學(xué)作用有關(guān)。過表達是將目的基因克隆到載體上，轉(zhuǎn)染進入細胞，目的基因在表達載體的啟動下啟動表達過程，從而實現(xiàn)過表達。RNA干擾(RNAi)［3］技術(shù)因其高效且特異的靶基因抑制而在基因功能研究和疾病的基因治療中顯示出巨大的潛在應(yīng)用價值。2012年10月～2013年11月，我們構(gòu)建了RACK1過表達載體和小干擾RNA(siRNA)表達載體，旨在為進一步研究RACK1在心律失常中的作用及分子機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 載體 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-Zs-Green和PIRES2-EGFP、大腸桿菌JM109和人肝癌細胞株Huh-7.5.1(昆明理工大學(xué)夏雪山課題組惠贈);限制性內(nèi)切酶 SalⅠ、BglⅡ、HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA Ligase、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒和TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司);Trizol(Invetrogen公司);質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司);其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 RACK1過表達載體的構(gòu)建 人肝癌細胞株Huh-7.5.1 經(jīng) Trizol試劑提取獲得總 RNA，使用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒獲得cDNA，使用外圍引物 WF1:5＇-AGTGCCATCCTCGTCGCTGC-3＇和WR1:5＇-TTTGTAAAGCTCTGCCATAAACTTCTAG-3＇擴增;1%凝膠電泳確定條帶大小正確后再用內(nèi)圍引物 NF1:5＇-GGAAGATCTATGACTGAGCAGATGACCCTTCGTG-3＇(下劃線為 BglⅡ酶切位點)和 NR1:5＇-ACGCGTCGACTCAGCGTGTGCCAATGGTCAC-3＇(下劃線為SalⅠ酶切位點)繼續(xù)擴增，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)BglⅡ和SalⅠ雙酶切后與同樣雙酶切后的真核表達載體PIRES2-EGFP連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，涂平板篩選挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)后行菌液PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察基因片段大小。挑選PCR鑒定合格的菌液送上海生物工程有限公司測序。重組質(zhì)粒命名為PIRES2-EGFP/RACK1。

1.3 RACK1干擾載體的構(gòu)建

1.3.1 干擾靶點的選擇 根據(jù)siRNA設(shè)計原則針對RACK1基因選擇 2個靶點:靶點1為 5＇-GGGAUGAGACCAACUAUGG-3＇(RACK1-Ⅰ)，位 于CDS140-158;靶點 2 為 5＇-GGUAUGGAACCUGGCUAAC-3＇(RACK1-Ⅱ)，位于 CDS525-543，另設(shè)計通用 陰 性 對 照 5＇-GACTTCATAAGGCGCATGC-3＇(HK)。在寡核苷酸片段的5＇和3＇端分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，便于與RNAi-ReadypSIRENRetroQ-ZsGreen載體連接，中間為9個插入序列TTCAAGAGA，形成發(fā)夾環(huán)。最后，在插入的目的DNA片段里，設(shè)計一個HindⅢ的酶切位點，位于EcoRⅠ和BamHⅠ位點之間，多聚T之后便于酶切鑒定。核苷酸由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3.2 單鏈目的基因片段的退火連接 將合成的3對單鏈DNA Oligos用 ddH2O稀釋到10 μM/mL。各取 3 μL 加 12 μL ddH2O 及 2 μL T4 DNA ligase buffe于 PCR 儀中，按照94 ℃ 5 min，80、70、60、50、40、30、20、10、4 ℃各 2 min 的程序進行退火。

1.3.3 酶切和連接反應(yīng) 質(zhì)粒 RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，37℃、4 h，1%瓊脂糖凝膠回收線性化載體。將3對寡核苷酸雙鏈分別和線性化載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen 按2∶1 比例混合，1 μL T4 DNA連接酶16℃連接過夜。

1.3.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選 氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞JM109大腸桿菌，涂布于含Amp抗性的LB平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜，從每個培養(yǎng)皿上各挑取1個單克隆菌落擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。

1.3.5 重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒以HindⅢ單酶切后測序鑒定，獲得3個重組質(zhì)粒pRetroQ/RACK1-1，pRetroQ/RACK1-2和 pRetroQ/HK。

1.4 重組質(zhì)粒與對應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染HUVEC細胞HUVEC細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)染前1 d鋪于6孔板，每孔2×105個細胞，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約24 h。用DMEM洗細胞2次，加入無血清和雙抗的DMEM 2 mL。按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明書，分別將重組質(zhì)粒 4 μL(1 μg/μL)和脂質(zhì)體 10 μL 加入 250 μL Opti-MEⅠ中混勻，靜置5 min。將兩液混合，室溫靜置20 min，輕輕覆蓋細胞表面，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，換用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液。同時轉(zhuǎn)染空載體做對照。48 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 RACK1基因編碼區(qū)序列的分離及其過表達載體的鑒定 經(jīng)外圍引物WF1和WR1擴增人RACK1基因cDNA后，再用內(nèi)圍引物NF1和NR1繼續(xù)擴增，得到自起始密碼子(ATG)到終止密碼子(TAG)之間954 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與目的基因大小一致;經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，過表達載體 PIRES2-EGFP/RACK1的菌落PCR產(chǎn)物與目的條帶一致;測序結(jié)果經(jīng)blast比對分析，插入序列與目的基因序列完全相同，表明過表達載體構(gòu)建成功。

2.2 小干擾 RNA表達載體的鑒定 pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK干擾載體用HindⅢ進行單酶切后，均酶切為約2.5 kb和4.2 kb的2個片段，與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果與設(shè)計的寡核苷酸序列一致，證明RACK1的小干擾RNA真核表達載體構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒對HUVEC細胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果 以未轉(zhuǎn)染細胞為對照，48 h可見綠色熒光蛋白表達約50%～80%，并分布于整個細胞，呈胞質(zhì)分布，表明過表達載體和干擾載體構(gòu)建成功并能在HUVEC中表達。

3 討論

RACK1是一種被證明的胞質(zhì)支架蛋白，能與有活性的蛋白激酶C(PKC)相互作用，并結(jié)合于PKC上，參與 PKC的轉(zhuǎn)位和活化［4］。在心肌細胞中，PKCs可調(diào)控 RACK1 的表達［5］。RACK1 除了與PKC相互作用外，還與其他多種蛋白或信號分子相互作用，如磷酸二酯酶 PDE4D5［6］、MCM7［7］、脂聯(lián)素受體 1［8］和 FAK［9］等，是 Src 酪氨酸激酶的一種重要底物，向下傳遞生長因子受體酪氨酸激酶的信號，參與Src功能調(diào)節(jié)和細胞生長的調(diào)節(jié)［10］。此外，RACK1 還能調(diào)節(jié) Ca2+的釋放［11，12］，而細胞內(nèi)外Ca2+濃度對心肌興奮性、血管伸縮狀態(tài)至關(guān)重要。人RACK1蛋白由鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白βⅡ(GNB2L1)編碼，后者有8個外顯子和7個內(nèi)含子［13，14］，其 CDS 全長 954 bp，編碼 317 個氨基酸的蛋白。GNB2L1位于染色體5q35.3，在接近5號染色體的端粒處［13］。RACK1在大多數(shù)組織中高效表達［13］，且序列嚴格保守［14］。

構(gòu)建過表達載體時我們從人RACK1 mRNA序列(NM_006098.4)中選取CDS區(qū)段作為目的片段，并在兩端各加上限制性酶切位點便于與雙順反子表達載體PIRES2-EGFP連接。PIRES2-EGFP為雙順反子載體，故真核表達載體PIRES2-EGFP在翻譯時與EGFP同時進行，在同一條mRNA鏈上以2個閱讀框進行翻譯，所表達的蛋白質(zhì)為非融合蛋白，避免了與外源性標記蛋白融合而影響RACK1的生物學(xué)活性。此外，本實驗構(gòu)建的過表達載體PIRES2-EGFP/RACK1同時帶有綠色熒光蛋白基因和新霉素抗性Neor基因作為雙選標記，因此可在轉(zhuǎn)染細胞后通過Neor篩選出基因陽性克隆細胞。

RNAi目前主要通過兩種方法得以實現(xiàn):一種是體外化學(xué)合成法人工制備siRNA，此法操作簡單、快速，但RNAi效應(yīng)往往是暫時的;一種為細胞內(nèi)表達的siRNA［15］，后者干擾效率高、作用持久、可穩(wěn)定遺傳給子代且并未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒效應(yīng)［16］。若后續(xù)實驗周期長或是特殊要求則優(yōu)先考慮構(gòu)建siRNA表達載體，本文考慮到后續(xù)膜片鉗等實驗，故構(gòu)建表達siRNA的真核表達載體。在干擾序列的選擇上，我們選擇的序列曾被作為靶系列化學(xué)合成siRNA，并且在前列腺癌細胞LNCaP中證明干擾效果好［17］。RACK1在不同細胞中表達水平不同，同一個干擾載體在不同細胞中的干擾效果可能也不同，故我們構(gòu)建了3個表達siRNA的真核表達載體(兩個干擾載體，一個陰性對照載體)，以便篩選出一個干擾效果最好的載體用于后續(xù)研究。

本研究成功構(gòu)建了能在體內(nèi)長期表達的RACK1過表達載體PIRES2-EGFP/RACK1和RNA干擾載體 pRetroQ/RACK1-1、pRetroQ/RACK1-2和pRetroQ/HK，這為后續(xù)從正反方面研究RACK1在心律失常中的功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

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