高惡斌 王子乾

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

分子生物學(xué)方法在浮游病毒多樣性研究中的應(yīng)用

高惡斌 王子乾

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013）

病毒是海洋及淡水微生物群落的重要組成部分，在調(diào)控微生物環(huán)路、驅(qū)動(dòng)生物地球化學(xué)循環(huán)、維持浮游植物與細(xì)菌多樣性等方面扮演著重要角色。然而，傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及定量技術(shù)難以對(duì)浮游病毒群落結(jié)構(gòu)與多樣性進(jìn)行深入而全面的解析。微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用為此提供了新的途徑。概述了克隆文庫(kù)分析方法、凝膠脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）技術(shù)、DNA指紋圖譜、DNA微陣列、宏基因組技術(shù)等分子生物學(xué)方法的基本概念及其在研究浮游病毒的種群結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性及其與環(huán)境因素之間的相互關(guān)系等方面的應(yīng)用狀況。

分子生物學(xué)方法 浮游病毒 群落結(jié)構(gòu) 遺傳多樣性

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)病毒廣泛存在于海洋及淡水環(huán)境中，構(gòu)成水生微生物群落的重要組成部分［1，2］，其豐度高于細(xì)菌1-2個(gè)數(shù)量級(jí)別，每升水中的數(shù)量高達(dá)109個(gè)病毒粒子［3］?？茖W(xué)家曾推測(cè)，如果將海洋中龐大數(shù)量的病毒頭尾相連排成一列，則這個(gè)隊(duì)列的長(zhǎng)度將比地球附近的60個(gè)星系相互間的距離總和還要長(zhǎng)［4］。這一驚人發(fā)現(xiàn)使得人們對(duì)病毒在水環(huán)境中的生態(tài)學(xué)意義有了重新認(rèn)識(shí)，同時(shí)也激發(fā)了人們對(duì)病毒生態(tài)學(xué)功能的研究興趣。甚至有科學(xué)家認(rèn)為這一重大發(fā)現(xiàn)如果提早若干年，很有可能影響海洋地理及湖沼現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展方向［5］。如今，海洋及淡水中的病毒及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用是病毒學(xué)與生態(tài)學(xué)研究相互滲透而成的一個(gè)新的研究方向，成為水環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［6，7］。

浮游病毒是一個(gè)生態(tài)學(xué)概念，指懸浮于水體中的各類病毒，包括噬菌體、噬藻體、真核藻病毒和其他動(dòng)植物病毒等［8，9］。以原核生物為宿主的噬菌體與噬藻體是浮游病毒的主要類群，具有豐富的遺傳多樣性。它們雖然個(gè)體極為微小，但十分活躍，是水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的重要調(diào)控者，在調(diào)節(jié)水體微生物種群大小、結(jié)構(gòu)與多樣性方面具有顯著作用［10，11］，而且在微生物食物環(huán)（Microbial loop）［12］、生物地球化學(xué)循環(huán)［5］、微生物之間的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移［13］，以及全球氣候變化［14］等方面起著不可忽視的作用。浮游病毒是引起水生態(tài)環(huán)境中浮游細(xì)胞生物死亡的主要因素之一，對(duì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)演替與水體初級(jí)生產(chǎn)力等起著重要作用［15，16］。特別是對(duì)有害藻類細(xì)胞的裂解作用，使得病毒在防治有害藻華（赤潮）方面非常具有發(fā)展?jié)摿Γ?7，18］。浮游病毒的群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究，有助于人們更加深入地認(rèn)識(shí)浮游病毒在水生態(tài)系統(tǒng)中的地位與功能及其宿主微生物之間的相互關(guān)系，甚至為開(kāi)發(fā)浮游病毒及其基因資源用于改善與保護(hù)水生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

對(duì)于浮游病毒的研究，最初著重于新病毒的分離鑒定、形態(tài)特征、生物學(xué)特性以及與宿主相互關(guān)系的研究，而關(guān)于它們?cè)谒w中的種群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因素之間的生態(tài)學(xué)意義所知甚少。直到20世紀(jì)90年代后，隨著微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在微生物多樣性及生態(tài)功能研究中的廣泛應(yīng)用，為研究浮游病毒遺傳多樣性提供了新的方法。微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)涉及生物學(xué)、基因組學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的理論知識(shí)，主要以病毒基因組DNA的序列信息為依據(jù)，通過(guò)檢測(cè)浮游病毒種群DNA序列多態(tài)性，鑒定個(gè)體的基因型，在基因水平評(píng)價(jià)種群遺傳分化，并在分子水平上闡述浮游病毒的組成和群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化，更好地揭示病毒與環(huán)境之間的生態(tài)學(xué)意義。目前，應(yīng)用于原位環(huán)境中浮游病毒種群結(jié)構(gòu)與多樣性研究的微生物分子生態(tài)學(xué)方法主要包括基于PCR的克隆文庫(kù)分析方法、凝膠脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）、DNA指紋圖譜、DNA微陣列和宏基因組文庫(kù)等。微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)克服了病毒分離培養(yǎng)的限制，可以在核酸水平上闡明浮游病毒遺傳多樣性及其動(dòng)態(tài)變化，極大了促進(jìn)了浮游病毒群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)學(xué)功能的研究。

1 克隆文庫(kù)

克隆文庫(kù)（Cloning library）分析方法是首先從環(huán)境樣品中提取出浮游病毒基因組總DNA，利用針對(duì)病毒的標(biāo)記基因序列設(shè)計(jì)通用引物對(duì)樣品總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與合適的克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌），得到大量含有不同標(biāo)記基因序列的轉(zhuǎn)化子，然后對(duì)這些轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因序列采用測(cè)序技術(shù)或PCR/RFLP進(jìn)行定性分析。對(duì)于測(cè)得的序列，可以通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有數(shù)據(jù)的對(duì)比鑒定其分類地位，或者分析標(biāo)記基因序列的類型和相對(duì)數(shù)量，從而得到浮游病毒群落結(jié)構(gòu)和多樣性的信息。

利用克隆文庫(kù)分析方法研究浮游病毒多樣性，關(guān)鍵是要確定好合適于浮游病毒檢測(cè)分析的標(biāo)記基因。目前，對(duì)于浮游病毒體多樣性的研究主要采用病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因g20、DNA聚合酶基因和輔助代謝基因等序列作為其檢測(cè)分子遺傳標(biāo)記。

1.1 結(jié)構(gòu)蛋白基因g20（Structural gene g20）

結(jié)構(gòu)蛋白g20基因（Structural gene g20）是肌尾病毒科中存在的一段編碼結(jié)構(gòu)蛋白基因，其序列相對(duì)保守［19］，被作為分子標(biāo)記用于研究浮游病毒的遺傳多樣性。研究者采用該基因序列作為遺傳標(biāo)記的研究結(jié)果揭示了浮游病毒具有相當(dāng)豐富遺傳多樣性，而且不同水環(huán)境之間遺傳多樣性差異較明顯。Chen等［20］通過(guò)針對(duì)g20基因序列并構(gòu)建克隆文庫(kù)，研究發(fā)現(xiàn)河口與開(kāi)放海域間藍(lán)藻病毒種類組成及結(jié)構(gòu)完全不同，同一位點(diǎn)處不同深度差異較大。Wilhelm等［21］采用此方法分析了聚球藻噬藻體在加拿大Laurentian湖的東、中和西部均有廣泛分布，而且淡水噬藻體與海洋噬藻體的遺傳多樣性有很大的相關(guān)性，但是又各成一支，推測(cè)其原因是與它們感染的藍(lán)藻宿主有關(guān)。

1.2 DNA聚合酶基因

DNA聚合酶（DNA Polymerase）是DNA復(fù)制所需的一種生化酶，具有高度保守的氨基酸序列，成為研究浮游病毒遺傳多樣性及其親緣關(guān)系的重要分子標(biāo)記。1995年，Short和Suttle［22］首次采用DNA聚合酶基因片段的特異性引物從自然界樣品中直接分離到病毒的pol基因?yàn)榛A(chǔ)，揭示了噬藻體和噬菌體的DNA聚合酶基因具有相似性。Labonté等［23］通過(guò)DNA聚合酶基因序列發(fā)現(xiàn)，加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣的短尾科病毒分布非常廣泛，且具有豐富的遺傳多樣性。Chen等［24］根據(jù)海洋短尾科噬藻體DNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)兼并引物，對(duì)美國(guó)切薩皮克海灣夏、冬兩季表層、中層及底層水中的藍(lán)細(xì)菌短尾病毒的多樣性和動(dòng)態(tài)組成進(jìn)行研究，揭示該海域短尾科藍(lán)藻病毒相當(dāng)豐富，且病毒種群結(jié)構(gòu)及多樣性呈現(xiàn)出明顯的季節(jié)性變化。黃思軍等［25］利用病毒DNA聚合酶基因序列對(duì)世界多處采集病毒樣品進(jìn)行擴(kuò)增，揭示了全球海洋中藍(lán)細(xì)菌短尾病毒的廣泛分布。

1.3 輔助代謝基因

輔助代謝基因（Auxiliary metabolic genes，AMGs）是病毒基因組中一類與宿主代謝功能相關(guān)的同源基因，在特殊的環(huán)境中可有助于提高病毒的生存適應(yīng)性［26-28］。這類基因序列廣泛存在于藍(lán)藻病毒（噬藻體）基因組，且由于不屬于某一特定的病毒科，可作為研究自然環(huán)境中藍(lán)藻病毒種群結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的分子標(biāo)記。目前，被作為標(biāo)靶基因的輔助代謝基因主要有光合作用基因psbA、psbD與焦磷核苷酸水解酶基因mazG，作為研究噬藻體遺傳多樣性及其與宿主藍(lán)藻間的相互關(guān)系的輔助方法。光合作用基因psbA、psbD分別編碼光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的的D1和D2蛋白，是宿主光調(diào)控的關(guān)鍵基因［29］，其序列具有一定的保守性。Chenard等［30］根據(jù)psbA基因序列對(duì)海洋及淡水噬藻體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海洋噬藻體具有不同于淡水噬藻體的進(jìn)化過(guò)程，而且藍(lán)藻與噬藻體同屬一進(jìn)化枝，由此推測(cè)噬藻體攜帶的光合基因來(lái)源其宿主。mazG是細(xì)菌中的焦磷核苷酸水解酶［31］，起到調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)壓力應(yīng)激的作用，是細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控子。Bryan等［32］發(fā)現(xiàn)mazG基因廣泛存在于以聚球藻為宿主的肌尾病毒科和短尾病毒科噬藻體中，且高度保守。此外，他們利用mazG基因檢測(cè)證明了噬藻體呈全球性分布，且不同噬藻體間頻繁進(jìn)行橫向基因轉(zhuǎn)移。將輔助代謝基因作為病毒檢測(cè)的分子標(biāo)記，不僅有助于認(rèn)識(shí)環(huán)境中浮游病毒種群多樣性，而且可以在功能基因水平上了解病毒與宿主生理狀況的密切聯(lián)系。

克隆文庫(kù)分析方法只有在分析的克隆數(shù)目足夠多的情況下，才可以比較完整地認(rèn)識(shí)種群組成的情況，PCR和克隆策略引入的誤差會(huì)對(duì)克隆出的標(biāo)記基因序列及其鑒定產(chǎn)生偏差。由于浮游病毒是高度差異的生物類群，缺少類似于細(xì)菌16S RNA的通用分子標(biāo)記，使得PCR獲得的數(shù)據(jù)不全面，具有選擇性。此外，克隆文庫(kù)分析法成本高，分析時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)病毒群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤研究受到很大的限制。

2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是一項(xiàng)依靠有規(guī)律地改變電場(chǎng)方向而使大分子DNA得以分離的電泳技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于所有的生物基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究。由于該技術(shù)具有重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)、易標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，不受表型形狀干擾等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是進(jìn)行分子生物學(xué)分型的可信方法之一，其為確定同種生物之間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)支持。

PFGE技術(shù)最初是用于分析羊瘤胃內(nèi)的噬菌體基因組大小［33］，后來(lái)逐漸被用于分析海洋病毒生態(tài)學(xué)研究［34-37］，并發(fā)展成為浮游病毒遺傳多樣性及其種群動(dòng)力學(xué)的重要研究方法。與常規(guī)的微生物計(jì)數(shù)法相比，該技術(shù)可以獲得不同水體中浮游病毒的群落結(jié)構(gòu)及多樣性、動(dòng)態(tài)變化、時(shí)空分布等特征。目前，PFGE技術(shù)已廣泛用于研究不同水體中浮游病毒基因組的大小、豐度及不同基因組大小浮游病毒與環(huán)境因素間的相互關(guān)系。Wommack等［8］采用PFGE技術(shù)對(duì)美國(guó)切薩皮克灣的浮游病毒種群動(dòng)力學(xué)進(jìn)行檢測(cè)，為期一年的研究結(jié)果表明該海灣內(nèi)的浮游病毒基因組大小范圍在50-300 kb之間，而且浮游病毒群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的時(shí)空變化。利用PFGE技術(shù)，Sandaa與Larsen［38］發(fā)現(xiàn)挪威海岸水域中的浮游病毒群落多樣性十分豐富，并呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化。劉艷鳴、張奇亞等［39］采用PFGE揭示中國(guó)武漢東湖存在5種不同大小的病毒基因組，大小范圍在15-300 kb之間，并證實(shí)了噬菌體和噬藻體是構(gòu)成東湖中浮游病毒群落的優(yōu)勢(shì)類群。Tijdens等［40］揭示了荷蘭Loosdrecht湖浮游病毒基因組大小在30-200 kb之間，并發(fā)現(xiàn)了該湖內(nèi)浮游病毒種群動(dòng)力學(xué)與環(huán)境參數(shù)密切相關(guān)。此外，利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)合DNA指紋圖譜方法對(duì)病毒裂解宿主后病毒及其宿主種群結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究，從而證實(shí)了病毒是調(diào)節(jié)水體微生物多樣性的重要因素［41］。近年來(lái)，病毒編碼的光合作用基因（psbA、psbD）及其生態(tài)學(xué)意義成為浮游病毒生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。研究認(rèn)為病毒的光合作用基因在感染宿主過(guò)程中的表達(dá)，能夠增強(qiáng)宿主光合能力，對(duì)增加病毒的裂解量與自身生存率具有重要作用［42，43］。為了探索自然環(huán)境中病毒光合作用基因及其多樣性，Sandaa等［44］利用PFGE方法對(duì)挪威海域浮游病毒類群進(jìn)行分離，再采用病毒光合作用基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFGE分離的病毒中多數(shù)都含有psbA和psbD，兩類病毒只含有psbA，一類病毒只含有psbD。

盡管PFGE是一種快速檢測(cè)病毒種群的方法，但該技術(shù)僅適于研究環(huán)境中浮游病毒群落的整體結(jié)構(gòu)，而對(duì)特定類群病毒基因組多樣性的研究還存在一定的不足。此外，對(duì)于基因組DNA大小相似的病毒，PFGE很難以有效的將它們區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而導(dǎo)致對(duì)病毒多樣性的檢測(cè)結(jié)果偏低。

3 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜（DNA fingerprinting）是用PCR擴(kuò)增浮游病毒樣品總DNA的標(biāo)記基因序列，然后用合適的電泳技術(shù)將其分離而成的具有特定條帶特征的圖譜。DNA指紋模式的不同就反映種群結(jié)構(gòu)的不同。按分離依據(jù)不同，DNA指紋圖譜可分為限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA圖譜和變性梯度凝膠電泳圖譜。

3.1 限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性

限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)是在生物多樣性研究中廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記。它的主要技術(shù)原理是應(yīng)用特定的核酸內(nèi)切限制酶切割有關(guān)的DNA分子，經(jīng)過(guò)電泳、原位轉(zhuǎn)膜印跡、探針雜交、放射性自顯影后，分析與探針互補(bǔ)的DNA片段在長(zhǎng)度上的簡(jiǎn)單變化。該技術(shù)具有全新、快速、高效等優(yōu)勢(shì)，可以在群落水平上提供幾乎無(wú)窮盡的、反映遺傳多樣性的可靠證據(jù)，可作為一種能高度靈敏檢測(cè)自然環(huán)境中微生物種群變化的方法。目前已應(yīng)用于浮游病毒群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)研究，以及作為一種鑒定未知病毒的篩選方法。1996年，Chen等［45］利用RFLP技術(shù)調(diào)查了墨西哥灣近海海域病毒群落的遺傳多樣性，得到了5個(gè)不同的系統(tǒng)分類單元（OTUs），均屬于藻DNA病毒科，其中4個(gè)屬于寄生藻病毒屬，而另1個(gè)OTU在寄生藻病毒屬和金藻病毒屬間形成1個(gè)單獨(dú)的分支。Marston等［46］利用RFLP技術(shù)研究美國(guó)羅德洲近海海域噬藻體遺傳多樣性時(shí)，鑒定了36種不同肌尾噬藻體的g20基因型，而推測(cè)短尾噬藻體與長(zhǎng)尾噬藻體是該海域內(nèi)噬藻體種群的主要成員。

3.2 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminate-restriction length fragment polymorphism，T-RFLP）是RFLP方法的進(jìn)一步發(fā)展，它是利用一定的標(biāo)記引物對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，在計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)分析時(shí)僅分析熒光標(biāo)記的末端限制片段，這樣使得限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性圖譜更為簡(jiǎn)化，并且每個(gè)可見(jiàn)的條帶都代表一個(gè)“核型”或一個(gè)分類單元。此法能夠得到一個(gè)群落的特征指紋圖譜，可用于比較不同群落的相似性以及群落結(jié)構(gòu)在時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)變化。Jiang等［47］利用T-RFLP技術(shù)調(diào)查研究了加利福尼亞南部海域的噬菌體遺傳多樣性，并鑒定了30種不同的基因組RFLP帶型，表明病毒多樣性遠(yuǎn)比其宿主的多樣性要豐富，而且感染相同或相似宿主的噬菌體遺傳學(xué)組成相似。他們還發(fā)現(xiàn)此海域的病毒基因組大小在40 kb-200 kb之間，并且呈垂直分布狀態(tài)，上層水域的病毒要比下層豐富。此外，Sobecky等［48］采用此方法發(fā)現(xiàn)水生態(tài)系統(tǒng)中病毒參與的水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，而病毒介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移是造成群落多樣性的一個(gè)重要原因。2004年，Wang等［49］研究美國(guó)切薩皮克灣噬藻體的遺傳多樣性與種群動(dòng)力學(xué)時(shí)，鑒別出許多新的g20序列，在15個(gè)g20序列中只有一個(gè)與已分離的噬藻體相近，而且T-RFLP圖譜分析表明該海灣中噬藻體的種群結(jié)構(gòu)及多樣性受季節(jié)性變化影響比空間變化影響更加明顯。通過(guò)采用T-RFLP技術(shù)，Labonté等［23］在加拿大喬治亞灣及墨西哥東北部灣得到了與短尾病毒相關(guān)的29個(gè)不同系統(tǒng)分類單元（OTUs），汪岷與閆群等［50］在我國(guó)青島近海春季水樣中共獲得11個(gè)病毒OTUs，并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)的方法發(fā)現(xiàn)這11個(gè)OTUs聚成了3簇。

3.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Randomly amplified poly-morphic DNA，RAPD）由Williams建立的［51］，是利用隨意設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度為8-10 bp的非特異引物，在不嚴(yán)格的PCR條件下（低退火溫度）對(duì)基因組DNA隨機(jī)擴(kuò)增，獲得一系列大小不同的產(chǎn)物，通過(guò)電泳而產(chǎn)生了由一系列條帶組成的指紋圖譜。該技術(shù)克服了RFLP方法的局限性，不需了解DNA序列，具有操作簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。Winget等［52］采用RAPD-PCR評(píng)估Chesapeake海灣中浮游病毒群落的豐富度動(dòng)態(tài)變化，揭示了浮游病毒時(shí)間變化要比空間變化更加明顯。相比其他檢測(cè)技術(shù)，RAPD-PCR在研究浮游病毒多樣性時(shí)顯得更加實(shí)用有效。

3.4 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）方法是最先用于檢測(cè)DNA突變的一種電泳技術(shù)［53］。它主要是通過(guò)在一般聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上添加了呈梯度分布的化學(xué)變性劑（如尿素和甲酰胺），使核苷酸序列不同分子相近的DNA片段沿著化學(xué)梯度的差異而滯留于凝膠的不同位置，從而形成相互分開(kāi)的圖譜，該圖譜可以看成是微生物群落中主要種類的一個(gè)輪廓。該技術(shù)具有可重復(fù)和容易操作等特點(diǎn)，能夠提供微生物群落中優(yōu)勢(shì)種類信息和同時(shí)分析多個(gè)樣品，適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化、種群成員鑒定。

該方法往往結(jié)合PCR同時(shí)使用，首先利用針對(duì)標(biāo)記基因序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用DGGE把不同的堿基組成的序列分開(kāi)，按照條帶位置的不同割取相應(yīng)條帶測(cè)序，進(jìn)而分析病毒的多樣性和動(dòng)態(tài)變化。DGGE結(jié)合PCR方法已成為揭示自然環(huán)境中浮游病毒群落結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及種群動(dòng)態(tài)分析的有效手段。1999年，Short和Suttle針對(duì)藻類病毒特異性DNA多聚酶（pol）基因片段進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，通過(guò)DGGE技術(shù)分離PCR擴(kuò)增片段并對(duì)不同片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析［54］，從而得知自然海洋水中不同位置藻病毒群落的遺傳多樣性。2005年，他們?cè)俅尾捎猛瑯拥姆椒ǚ治隽撕Ｑ蟓h(huán)境中噬藻體群落的遺傳多樣性［55］，并初步證實(shí)了噬藻體與宿主間的依賴關(guān)系以及它們?cè)诘乩矸植忌喜o(wú)直接聯(lián)系的進(jìn)化特點(diǎn)。Wilson等［56］采用該技術(shù)方法對(duì)?？颂m群島到英聯(lián)合王國(guó)的大西洋橫斷面噬藻體多樣性空間分布進(jìn)行研究，揭示了噬藻體的遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)組成還與水體分層密切相關(guān)。Schroeder等［57］采用此方法分析了球石藻赤潮前后海洋病毒的多樣性與種群動(dòng)力學(xué)，得出浮游病毒種群多樣性發(fā)生了改變，Dorigo等［58］采用此方法研究法國(guó)Bourget淡水湖中噬藻體多樣性及其與環(huán)境因素相互關(guān)系。最近，Chénard與Suttle［59］利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)淡水和海洋噬藻體psbA基因片段進(jìn)行分析，結(jié)果揭示了淡水噬藻體與海洋噬藻體的psbA基因有不同的進(jìn)化史，同一地理區(qū)域的噬藻體psbA基因結(jié)構(gòu)也存有差異。

4 核酸探針檢測(cè)技術(shù)

核酸探針檢測(cè)技術(shù)（Nucleic acid probe technology）是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，被標(biāo)記的特異性核苷酸探針（用放射性元素或熒光染料標(biāo)記）以原位雜交、Southern印跡雜交、斑點(diǎn)印跡和狹線印跡雜交等不同方法，可直接用來(lái)檢測(cè)待測(cè)樣品中的同源核酸序列，從而獲得DNA序列及片段長(zhǎng)度多態(tài)性。由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的研究中，定性定量分析它們的存在、分布和豐度。近年來(lái)，此方法被用于水環(huán)境中的病毒群落的檢測(cè)與生態(tài)作用研究。Wommack等［60］采用核酸雜交技術(shù)分析了Chesapeake海灣中浮游病毒群落的時(shí)空動(dòng)力學(xué)及其宿主生物之間的相互關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒在時(shí)間與空間上發(fā)生顯著的豐度變化，并且是導(dǎo)致細(xì)菌與浮游植物群落遺傳多樣性的重要因素。

該技術(shù)所采用的探針必須是已知的病毒序列，其檢測(cè)結(jié)果只是已知的病毒，得不到新的病毒基因。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里的病毒序列信息非常有限，難以獲得較為全面的病毒檢測(cè)探針，因而在分析浮游病毒多樣性時(shí)獲得的相關(guān)信息比較少。

5 DNA微陣列

DNA微陣列（DNA chip）也稱為基因芯片（G-eochip），是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)，它是采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法，將成千上萬(wàn)個(gè)基因有序的排列在固體載體上而形成微矩陣，待檢測(cè)樣品用熒光分子標(biāo)記后，與微陣列雜交，通過(guò)熒光掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量基因的表達(dá)類型、突變情況及不同基因的組成與變化情況，以達(dá)到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。

DNA微陣列應(yīng)用于病毒多樣性研究主要是從球石藻病毒的全基因組測(cè)序開(kāi)始，Allen等［61］以球石藻病毒EhV-86全基因組序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)探針并構(gòu)建EhV-86的DNA微陣列，從基因水平上評(píng)估球石藻病毒屬的多樣性，也從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)查球石藻病毒的感染過(guò)程。然后他們利用標(biāo)記基因、宿主范圍和微陣列從基因型到表型上去探討球石藻病毒的株間多樣性，通過(guò)微陣列結(jié)果發(fā)現(xiàn)以前認(rèn)為是相同的兩個(gè)病毒株實(shí)際上存在較大差異［62］。以往基于PCR方法的單個(gè)基因研究，可以獲得浮游病毒遺傳多樣性的相關(guān)信息，而在確定屬內(nèi)病毒間的遺傳距離時(shí)受到限制，應(yīng)用DNA微陣列分析病毒屬內(nèi)的多樣性，可以很好地解決系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。DNA微陣列分析能檢測(cè)同源基因差異性，提供影響生物多樣性的重要信息，但僅限制于用已知病毒基因做探針，在分析中得不到新的基因。

6 宏基因組文庫(kù)（Metagenomics library）

宏基因組的概念是由Handelsman等于1998年首先提出的，也稱為環(huán)境基因組，其定義是指特定生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和［63］。與傳統(tǒng)方法相比，宏基因組技術(shù)主要利用非人工培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)、方法和手段進(jìn)行系統(tǒng)分析微生物在環(huán)境中的基因組集合，研究其群落結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能。宏基因組學(xué)研究的基本思路是直接提取環(huán)境中特定微生物群落的基因組總DNA，克隆到合適的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，形成一個(gè)高度復(fù)雜的重組DNA文庫(kù)，從文庫(kù)中獲得相關(guān)基因，避免了傳統(tǒng)微生物學(xué)基于分離培養(yǎng)研究的限制。

近年來(lái)，宏基因組學(xué)研究極大的推動(dòng)了環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，為充分認(rèn)識(shí)自然環(huán)境中浮游病毒群落的遺傳組成及其多樣性開(kāi)辟了新的研究途徑。2002年，Breitbart等［64］利用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)2個(gè)天然海水水體中的病毒群體進(jìn)行研究，開(kāi)啟了宏基因組學(xué)在浮游病毒研究領(lǐng)域的應(yīng)用。Breitbart等［65］運(yùn)用宏基因組學(xué)結(jié)合數(shù)學(xué)模型的方法，推算1 kg的近海表層沉積物中的病毒種類將超過(guò)地球上所有的爬行動(dòng)物種類的總和。Angly等［66］運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)北大洋、墨西哥灣、馬尾藻海域和哥倫比亞海域的病毒群體進(jìn)行了研究，探討了海洋病毒群落的結(jié)構(gòu)組成及及其分布狀況，并發(fā)現(xiàn)雙鏈DNA病毒可能是生物圈中遺傳多樣性的最豐富的群體之一。宏基因組學(xué)不僅可以提供自然環(huán)境中浮游病毒的群落結(jié)構(gòu)及多樣性數(shù)據(jù)，而且可以提供一些潛在的病毒種群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。Bench等［67］構(gòu)建了切薩皮克灣浮游病毒宏基因組文庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)大量的未知病毒和新病毒序列。Ngando等［68］利用宏基因組技術(shù)對(duì)Senegal的一個(gè)超鹽湖進(jìn)行了病毒多樣性研究，并發(fā)現(xiàn)了許多的序列與SEED數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配（SEED是由GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和已測(cè)的所有基因組序列組成的數(shù)據(jù)庫(kù)）。2009年，Sharon等［69］通過(guò)已經(jīng)獲得的環(huán)境病毒宏基因組文庫(kù)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與光系統(tǒng)I（PSI）相關(guān)的基因序列，并揭示了這些基因在噬藻體基因組中普遍存在。

利用宏基因組技術(shù)研究浮游病毒遺傳多樣性時(shí)，克服了浮游病毒沒(méi)有統(tǒng)一分子標(biāo)記的不足，能夠獲得比較全面可靠的數(shù)據(jù)。在宏基因組技術(shù)的應(yīng)用中，應(yīng)加強(qiáng)與其他技術(shù)相結(jié)合，以減少單一技術(shù)造成的偏差。對(duì)特定環(huán)境內(nèi)的浮游病毒群落多樣性進(jìn)行研究時(shí)，宏基因組文庫(kù)技術(shù)可避免PCR偏好性所導(dǎo)致的誤差，而PCR文庫(kù)可矯正構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的基因遺漏現(xiàn)象。因而，采用宏基因組文庫(kù)結(jié)合PCR文庫(kù)的分析方法，將會(huì)有助于不同環(huán)境中的病毒群落結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性的精確研究。

7 結(jié)語(yǔ)

分子生物學(xué)技術(shù)在浮游病毒生態(tài)學(xué)研究中已顯現(xiàn)其獨(dú)特的優(yōu)越性，成為一種快速分析浮游病毒群落組成結(jié)構(gòu)與多樣性的有效手段。在分析浮游病毒多樣性的過(guò)程中，通過(guò)采取多種分子生物學(xué)技術(shù)方法結(jié)合使用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，相互補(bǔ)充，可以減少單一分析技術(shù)的局限性，綜合各類技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，使獲得的浮游病毒生態(tài)學(xué)信息更為客觀、真實(shí)和有效。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Application of Molecular Biological Methods to Research on the Genetic Diversities of Virioplankton

Gao Ebin Wang Ziqian
（School of the Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

Viruses are recognized as an important component of aquatic microbial communities in marine and freshwater environments, and play a significant role in regulating microbial loop, driving global biogeochemical cycling and maintaining clonal diversities of phytoplankton and bacterioplankton populations. However, the structure and diversity of virioplankton communities have not been extensively and overall investigated using classical viral culture and quantitative methods, and the rapid development and application of molecular-ecological techniques offer a new way. The basic concept of some molecular biological methods including cloning library, PFGE, DNA fingerprinting, DNA chip and metagonemics were described, and their application to address the population composition and genetic diversities of virioplankton in natural aquatic environment, and to investigate the ecological relationship between virioplankton and environmental factors.

Molecular biological method Virioplankton Community structure Genetic diversity

2013-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200019），江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才啟動(dòng)基金（11JDG151），中國(guó)博士后科學(xué)基金（20110491363）

高惡斌，男，博士，研究方向：微生物分子生態(tài)學(xué)；E-mail: gaofei7908@126.com