張興，李麗娜，林孟柯，寧艷哲，凌雅睿，田小瓏，王茂晉，張忠

孤獨(dú)癥又稱自閉癥，是一種由于神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致的發(fā)育障礙，其表現(xiàn)為不能進(jìn)行正常的語言表達(dá)和社交活動(dòng)，常做一些刻板和重復(fù)性的動(dòng)作和行為。認(rèn)知障礙是孤獨(dú)癥的核心癥狀之一，可引起嚴(yán)重學(xué)習(xí)、記憶障礙，同時(shí)伴有失語、失用、失認(rèn)或失行等改變。值得注意的是，25%～84%的孤獨(dú)癥患兒有胃腸道癥狀，而且胃腸道癥狀與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[1-6]。

最近一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，與正常組兒童對(duì)比，孤獨(dú)癥患兒便秘和挑食現(xiàn)象更多見[7]。這些現(xiàn)象提示孤獨(dú)癥與胃腸癥狀的產(chǎn)生可能有相同的機(jī)制。目前這方面的研究還局限于臨床，實(shí)驗(yàn)研究較少。罕見關(guān)于孤獨(dú)癥模型動(dòng)物胃腸功能改變的報(bào)道。筆者對(duì)孤獨(dú)癥大鼠發(fā)育過程中認(rèn)知與胃腸功能的變化規(guī)律進(jìn)行了觀察，希望能為后續(xù)的機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康清潔級(jí)SD大鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2012-0001)，雌性，240～260 g 2只，雄性280 g 1只。于北京中醫(yī)藥大學(xué)科研中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心清潔級(jí)大鼠飼養(yǎng)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1周后，每日下午5時(shí)，將雄性大鼠與雌性大鼠1只合籠，次日早晨7時(shí)觀察飼養(yǎng)籠內(nèi)的陰栓有無，以確定雌性大鼠是否受孕，以觀察到陰栓出現(xiàn)為受孕第1天。雄鼠休息5 d后，與另一只雌鼠重復(fù)此操作。所孕幼鼠出生后即為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 微量電子秤，恒溫水箱，大鼠避暗穿梭箱(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，編號(hào)：201202098)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司EthoVision系統(tǒng))，5 mL注射器，灌胃針，活性炭(國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司)，生理鹽水，注射用丙戊酸鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 孤獨(dú)癥模型建立 12.5 d時(shí)對(duì)孤獨(dú)癥模型孕鼠進(jìn)行尾靜脈注射丙戊酸鈉(注射用水稀釋為250 g/L，600 mg/kg)，其所生幼鼠為孤獨(dú)癥模型組；對(duì)照組孕鼠妊娠12.5 d時(shí)注射等劑量生理鹽水，其所生幼鼠為對(duì)照組。

1.3.2 孤獨(dú)癥大鼠模型發(fā)育情況 (1)分別測(cè)量對(duì)照組、模型組幼鼠出生第7、14、21、56天的體質(zhì)量情況。(2)觀察生后第9、11、13天時(shí)幼鼠在25 ℃恒溫箱中的游泳情況，每次1只，觀察5～10 s，計(jì)分依據(jù)：0分：頭和鼻子均在水下；1分：頭在水上，鼻子在水下；2分：頭和鼻子在水上或與水面齊，但雙耳在水下；3分：水位線在雙耳中間；4分：水位線在耳朵以下。測(cè)試后將幼鼠擦干放回籠內(nèi)。

1.3.3 胃腸感覺和運(yùn)動(dòng)功能 (1)結(jié)腸疼痛閾值：參考文獻(xiàn)[8]方法并加以改進(jìn)測(cè)定結(jié)腸疼痛感覺閾值：以超薄橡膠膜制作氣囊，固定于聚丙烯塑料管上，塑料管一端與氣囊相通，另一端與壓力計(jì)和注射器相連接。將帶氣囊的塑料管插至大鼠降結(jié)腸，固定。向氣囊內(nèi)緩慢注氣直至出現(xiàn)腹部肌肉收縮，此時(shí)壓力即為疼痛感覺壓力閾值。每只大鼠重復(fù)測(cè)試5次，每兩次間隔5 min，結(jié)果取均值。(2)胃腸通過時(shí)間：采用活性炭灌胃法測(cè)定首粒黑便排出時(shí)間作為胃腸道通過時(shí)間，判斷胃腸運(yùn)動(dòng)功能。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，次日上午9：00開始用質(zhì)量濃度為0.1 g/L的活性炭懸液灌胃，觀察幼鼠首粒黑便的排出時(shí)間。

1.3.4 學(xué)習(xí)與記憶能力——避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 避暗儀暗室底部銅柵通36 V、50 Hz交流電，先將幼鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練3 min，正式測(cè)試開始時(shí)將幼鼠背對(duì)洞口放入明室，幼鼠進(jìn)入暗室則受到電擊，避暗儀自動(dòng)記錄5 min內(nèi)幼鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)，即為錯(cuò)誤次數(shù)，和首次進(jìn)入暗室的時(shí)間，即為避暗潛伏期。第1天上午9：00開始訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，次日上午9：00(訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)24 h后)進(jìn)行測(cè)試，記錄5 min內(nèi)幼鼠避暗潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3.5 自發(fā)行為與探索行為——曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 小動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)中將曠場(chǎng)分析箱從左上開始，按左到右順序以不同顏色編號(hào)為相同的25個(gè)小格，其中7、8、9、12、13、14、17、18、19為中央?yún)^(qū)域，其余為外周格，13號(hào)格為正中格。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)捏住大鼠尾巴距根部2/3處輕放入13號(hào)格中，顯示器中觀察其3 min內(nèi)活動(dòng)情況，每次測(cè)定結(jié)束將動(dòng)物排泄物清除干凈，每只僅測(cè)定1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)間結(jié)束錄像分析，軟件統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，采用t檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠發(fā)育狀況

2.1.1 體質(zhì)量情況 見表1。

表1 孤獨(dú)癥大鼠與正常大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組比較，az=-2.14，P<0.05，bz=-4.12，-3.89，P<0.01。

表1數(shù)據(jù)顯示，孤獨(dú)癥模型組大鼠體質(zhì)量在各個(gè)時(shí)期的平均水平均低于對(duì)照組，其中第7、14、21天低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，0.01)。

2.1.2 游泳能力 見表2。

表2 幼鼠游泳能力評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，at=-3.19，-4.42，-3.55，P<0.01。

表2數(shù)據(jù)顯示，第9、11、13天，孤獨(dú)癥模型組游泳能力評(píng)分明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 胃腸感覺與運(yùn)動(dòng)功能

2.2.1 結(jié)腸疼痛閾值 見表3。

表3 幼鼠結(jié)腸疼痛閾值

注：與對(duì)照組比較，az=-2.41，-2.14，P<0.05，bz=-2.74，-3.23，P<0.01。

表3數(shù)據(jù)顯示，孤獨(dú)癥模型組在第29、36、43、57天與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，0.01)。對(duì)照組幼鼠結(jié)腸痛閾基本恒定，而孤獨(dú)癥模型組結(jié)腸痛閾低于對(duì)照組，提示孤獨(dú)癥幼鼠發(fā)育過程中存在胃腸感覺超敏狀況。

2.2.2 胃腸通過時(shí)間 見表4。

表4 幼鼠胃腸通過時(shí)間

注：與對(duì)照組比較，az=-2.41，P<0.05，bz=-3.34，P<0.01。

表4數(shù)據(jù)顯示，隨著幼鼠的生長發(fā)育，對(duì)照組與孤獨(dú)癥模型組的胃腸通過時(shí)間均逐漸延長，孤獨(dú)癥模型組的胃腸通過時(shí)間除在第36天長于對(duì)照組；其余各時(shí)點(diǎn)均短于對(duì)照組，第43天胃腸通過時(shí)間明顯短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，0.01)。

2.3 學(xué)習(xí)與記憶能力——避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 見表5、6。

表5 幼鼠避暗潛伏期

注：與對(duì)照組比較，az=-3.06，-2.78，-3.04，P<0.01。

表6 幼鼠避暗錯(cuò)誤次數(shù)次)

注：與對(duì)照組比較，az=-3.07，-3.55，-3.31，P<0.01。

表5、6數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組比較，孤獨(dú)癥模型組在初次受到傷害性刺激時(shí)，記憶形成不穩(wěn)固，錯(cuò)誤次數(shù)增多。而多次受到傷害性刺激后，記憶穩(wěn)固，避暗潛伏期在第37、44、51天均長于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而避暗錯(cuò)誤次數(shù)僅在第23天高于正常對(duì)照組，第30天與對(duì)照組基本一致，而第37、44、51天均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩項(xiàng)數(shù)據(jù)均顯示，第58天兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

2.4 曠場(chǎng)試驗(yàn) 孤獨(dú)癥模型組第29、50天運(yùn)動(dòng)距離少于對(duì)照組；孤獨(dú)癥模型組第50天穿格次數(shù)少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7、8。

表7 幼鼠總運(yùn)動(dòng)距離

注：與對(duì)照組比較，az=-2.03，-2.14，P<0.05。

表8 幼鼠穿格次數(shù)

注：與對(duì)照組比較，az=-2.22，P<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孤獨(dú)癥模型在幼年發(fā)育過程中，其體質(zhì)量增長低于對(duì)照組；運(yùn)動(dòng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力均低于正常水平，游泳能力的不足正說明了這一點(diǎn)。

很早以前，研究者就注意到孤獨(dú)癥患兒中存在的胃腸功能障礙[9]。也有研究者認(rèn)為，伴有胃腸功能障礙的孤獨(dú)癥是孤獨(dú)癥的一個(gè)亞型。有研究結(jié)果提示，一些基因可能是孤獨(dú)癥和胃腸功能障礙之間的聯(lián)系[10-12]，但孤獨(dú)癥與胃腸功能障礙之間的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步探索。這方面的研究對(duì)于闡明孤獨(dú)癥的病因病理具有重要的意義。

目前雖然已經(jīng)建立了多種孤獨(dú)癥動(dòng)物模型，以研究孤獨(dú)癥的病理改變機(jī)制，但大多數(shù)研究都集中在認(rèn)知障礙方面，很少有關(guān)于胃腸功能障礙的機(jī)制研究。筆者觀察丙戊酸鈉致孤獨(dú)癥幼鼠胃腸功能和認(rèn)知能力的發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)該模型幼鼠體質(zhì)量減輕，在出生第29天就出現(xiàn)胃腸功能障礙，表現(xiàn)為結(jié)腸痛閾降低，結(jié)腸敏感性增強(qiáng)，胃腸通過時(shí)間縮短或延長，胃腸運(yùn)動(dòng)障礙。這些與臨床患兒胃腸癥狀相似。說明丙戊酸鈉致孤獨(dú)癥大鼠模型可用于研究胃腸功能障礙與孤獨(dú)癥內(nèi)在聯(lián)系。

值得注意的是，避暗反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，孤獨(dú)癥幼鼠僅在第1次實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤次數(shù)高于對(duì)照組，第2次實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)與對(duì)照組持平，其后各次實(shí)驗(yàn)中，錯(cuò)誤次數(shù)均顯著少于對(duì)照組。提示孤獨(dú)癥動(dòng)物對(duì)傷害性刺激記憶深刻，這可能是由于模型動(dòng)物感覺超敏所致。而第37天之后避暗反應(yīng)潛伏期延長可能與模型動(dòng)物對(duì)傷害性刺激的記憶有關(guān)。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組和孤獨(dú)癥模型組幼鼠運(yùn)動(dòng)距離隨日齡增加而延長。孤獨(dú)癥模型組幼鼠運(yùn)動(dòng)距離低于對(duì)照組，提示孤獨(dú)癥幼鼠自發(fā)活動(dòng)減少。另外，對(duì)照組和孤獨(dú)癥模型組幼鼠穿格次數(shù)均隨日齡增加而延長，孤獨(dú)癥模型組幼鼠穿格次數(shù)低于對(duì)照組，提示幼鼠探索行為減少。

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