李大亮 張 輝 呂文博

(1.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025；2.哈爾濱藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

HPLC法測定獐芽菜苦苷含量及有關(guān)物質(zhì)

李大亮1張 輝2呂文博1

(1.黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025；2.哈爾濱藥業(yè)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

目的：為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立獐芽菜苦苷含量及有關(guān)物質(zhì)檢查方法。方法：采用高效液相色譜法，有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行專屬性、溶液穩(wěn)定性及檢測限方法驗證，采用含量測定方法進(jìn)行溶液穩(wěn)定性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性方法驗證試驗。結(jié)果：方法驗證結(jié)果表明所建立方法可行。結(jié)論：所建立方法可有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

HPLC法；獐芽菜；苦苷；含量；有關(guān)物質(zhì)；方法驗證

獐芽菜苦苷為獐芽菜中主要成分，因其藥理作用廣泛，越來越受到人們關(guān)注，市場上出現(xiàn)以獐芽菜苦苷為主要成分的制劑，如何控制獐芽菜苦苷制劑產(chǎn)品質(zhì)量，顯得尤為重要。通過相關(guān)研究建立獐芽菜苦苷含量及有關(guān)物質(zhì)檢查方法。

1 材料與儀器

獐芽菜苦苷對照品 來源：哈爾濱藥業(yè)股份有限公司

Agilent 1260高效液相色譜儀 廠家：安捷倫科技有限公司

色譜柱：Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm 廠家：天津博納艾杰爾科技有限公司

2 有關(guān)物質(zhì)檢查

2.1 有關(guān)物質(zhì)檢查方法篩選

參照相關(guān)文獻(xiàn)[1，2],對獐芽菜苦苷有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行篩選，流動相選擇甲醇及水進(jìn)行篩選，根據(jù)雜質(zhì)分離情況，確定流動相比例，同時進(jìn)行相關(guān)方法驗證。

2.2 耐用性試驗

通過對不同廠家的色譜柱進(jìn)行篩選，結(jié)果Venusil XBP C18對雜質(zhì)分離最好，當(dāng)甲醇∶水為30∶70時，各雜質(zhì)峰與主峰可有效分離。變換柱溫，改變流速，改變流動相比例，考察雜質(zhì)檢出情況，結(jié)果改變柱溫、流速、流動相比例，雜質(zhì)與主峰分離度符合規(guī)定，雜質(zhì)檢出量基本一致。

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗

取獐芽菜苦苷原料，加流動相制成0.25mg/ml溶液，分別于0、2、4、6、8h測定。結(jié)果供試品溶液在4h時雜質(zhì)增加較明顯，供試品溶液配制后在4h內(nèi)進(jìn)樣。

2.4 檢測限

取獐芽菜苦苷對照品，制成不同濃度溶液，進(jìn)樣，以信噪比約為3∶1為檢測限。結(jié)果本品檢測限溶液濃度為27ng/ml(信噪比為2.8)，供試品濃度與檢測限濃度比值約為8 000，溶液濃度可行。

2.5 專屬性

考察供樣品在酸、堿、氧化、高溫及強(qiáng)光條件下穩(wěn)定性，DAD檢測器全波長監(jiān)測，為確定檢測波長提供依據(jù)，評價在各條件下穩(wěn)定性及可能降解產(chǎn)物。結(jié)果獐芽菜苦苷樣品破壞前后峰純度均符合規(guī)定(DAD監(jiān)測)，說明主峰與雜質(zhì)峰可有效分離。各波長監(jiān)測結(jié)果表明在230nm波長處為最佳檢測波長。

2.6 已知雜質(zhì)研究

專屬性試驗中發(fā)現(xiàn)有一雜質(zhì)超過0.1%，初步分析該雜質(zhì)為獐芽菜苷，取獐芽菜苷對照品進(jìn)樣，結(jié)果表明該雜質(zhì)為獐芽菜苷。分別取獐芽菜苦苷及獐芽菜苷對照品，配制不同濃度溶液5份，分別進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比，計算二者相對響應(yīng)因子，結(jié)果獐芽菜苷與獐芽菜苦苷相對響應(yīng)因子為0.73。

2.7 有關(guān)物質(zhì)檢查

色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Venusil XBP C18)；以甲醇—水(30∶70)為流動相；檢測波長為230nm。理論板數(shù)按獐芽菜苦苷峰計算應(yīng)不低于5 000。取供試品加流動相制成0.25mg/ml溶液，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液1ml于100ml，加流動相至刻度，作為對照溶液。取供試品及對照溶液進(jìn)樣，獐芽菜苷不得過0.5%，單一雜質(zhì)不得過0.1%，總雜質(zhì)不得過1.0%。

取供試品按照確定方法檢查，結(jié)果獐芽菜苦苷為0.16%，單一未知雜質(zhì)0.03%，總雜質(zhì)0.31%。峰純度監(jiān)測符合規(guī)定。所建立有關(guān)物質(zhì)檢查方法可行，可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

3 含量測定

3.1 方法及色譜柱

供試品溶液濃度及流動相與有關(guān)物質(zhì)檢查方法相同，色譜柱Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm，廠家：天津博納艾杰爾科技有限公司。

3.2 系統(tǒng)適用性試驗

取獐芽菜苦苷對照品加流動相溶解制成0.25mg/ml溶液作為對照品溶液，精密量取對照品溶液10μl,重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果重復(fù)進(jìn)樣6次，主峰相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%，符合規(guī)定。

3.3 耐用性試驗

取對照品及供試品，按照擬建立方法通過改變流動相比例、流動相pH值、柱溫、流速及更換色譜柱(相同品牌，不同批號)考察分析方法本身偏差的影響，結(jié)果各條件微小變化含量測定結(jié)果偏差均符合規(guī)定，同時各條件下分離度及對稱因子均符合規(guī)定，塔板數(shù)較高，耐用性試驗符合要求。

3.4 線性試驗

精密稱取獐芽菜苦苷對照品，制成不同濃度的溶液，分別測定其主峰的面積。以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，主峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，結(jié)果線性試驗符合要求。

3.5 溶液穩(wěn)定性試驗

取供試品加水制成0.25mg/ml的溶液，分別于0、1、2、3、4h測定溶液峰面積，溶液在4h含量下降約0.5%，供試品溶液比較穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性試驗

精密稱取供試品，配制6份相同濃度溶液，進(jìn)樣，結(jié)果6份相同濃度樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，符合要求。

3.7 中間精密度試驗

在不同時間由不同分析人員使用不同儀器進(jìn)行試驗，精密稱取供試品溶液，配制6份相同濃度溶液，進(jìn)樣，計算12次試驗測定結(jié)果相對偏差，結(jié)果12次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%，中間精密度符合規(guī)定。

3.8 準(zhǔn)確度試驗

配制濃度為80%、100%和120%的供試品溶液各三份，采用加入法測定回收率，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。

對照品溶液制備：精密稱取獐芽菜苦苷對照品2份，分別于25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液制備：精密稱取獐芽菜苦苷樣品2份，分別于50ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定供試品含量為99.3%。

供試品溶液Ⅰ制備(80%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

供試品溶液Ⅱ制備(100%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

供試品溶液Ⅲ制備(120%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

取上述溶液按照含量測定方法進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.3%、99.6%、100.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%，準(zhǔn)確度試驗符合要求。系統(tǒng)適用性、耐用性、線性、重復(fù)性、溶液穩(wěn)定性、中間精密度及準(zhǔn)確度試驗結(jié)果表明含量測定方法可行。

3.9 含量測定

取樣品，按確定的含量測定方法測定，結(jié)果分別為99.8%、99.6%、99.4%。

4 結(jié)論

本文對獐芽菜苦苷有關(guān)物質(zhì)及含量檢查方法進(jìn)行驗證，方法學(xué)驗證結(jié)果表明所建立方法可行，并對樣品中已知雜質(zhì)進(jìn)行研究，并制定合理限度，所建立方法可以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。

[1]賈珍,楊鳳梅.高效液相色譜法測定藏茵陳注射液中獐芽菜苦苷的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2007，24(5):392～393.

[2]包同力嘎.HPLC法測定不同產(chǎn)地肋柱花中獐芽菜苦苷的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013，40(12):2 558～2 559.

責(zé)任編輯：桑詠梅

10.3969/j.issn.1674-6341.2014.04.011

2014-05-08

李大亮(1981-)，男，黑龍江哈爾濱人，講師，碩士。研究方向：中藥有效成分提取與分離。

R927.2

A

1674-6341(2014)04-0023-02