嚴繼貴， 王迎新， 楊宇清， 王雅潔

（安徽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系， 安徽 合肥 230601）

槐定堿 對骨癌痛 大鼠脊髓 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表達的影響

嚴繼貴， 王迎新， 楊宇清， 王雅潔

（安徽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系， 安徽 合肥 230601）

目的 觀察槐定堿對骨癌痛大鼠脊髓 N-甲基-D-天門冬氨酸 (NMDA) 受體亞型 NR2B mRNA和神經(jīng)元型一氧化氮合酶 (nNOS)mRNA表達的影響, 探討其抗癌痛的作用機制。 方法 將 W256 癌細胞注入 40 只 SD雌性大鼠骨髓腔復制 骨 癌痛模型 后 隨機分為 槐 定堿治療 組 (腹 腔 注射槐定 堿 25 mg/kg) 及 模 型對 照 組, 另 取 10 只 大 鼠骨 髓 腔 注 入生理鹽水, 治療前后 分 別測量大鼠 熱 痛閾和機 械 痛閾； 采用逆 轉 錄 PCR(RT-PCR) 檢 測 大鼠脊髓 NR2B mRNA和nNOSmRNA的表達。 結果 槐定堿能夠明顯提高 W256 癌細胞誘導的骨癌痛大鼠熱痛閾和機械痛閾, 明顯下調骨癌痛大鼠脊髓組織 NR2B mRNA和 nNOSmRNA的表達。 結論 槐定堿抗骨癌痛作用可能與下調脊髓與痛覺過敏密切相關的 NMDAR-nNOS/NO-cGMP信號轉導通路有關。

槐定堿； 骨癌痛； N-甲基-D-天門冬氨酸受體 2B亞基； 神經(jīng)元型一氧化氮合酶

槐定 堿 (C15H24N2O, 相 對 分 子 質 量 248.36)是一種從豆科槐屬植物苦豆子中提取分離的高效低毒單體生物堿,相關研究結果表明,該生物堿具有明顯的 鎮(zhèn) 痛 、 抗 腫 瘤、 抗 炎 等 多 種 藥 理 活 性［1-3］?，F(xiàn)臨床上使用的 “鹽酸槐定堿注射液” 為該生物堿已開發(fā)的制劑,但僅試用于抗惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤,其他適應癥有待于進一步開發(fā)。本課題組采用W256 癌細胞誘導的骨癌痛大鼠模型代替?zhèn)鹘y(tǒng)的疼痛模型,對槐定堿的抗癌痛作用進行了初步藥效評價和外周作用機制探討,研究結果顯示,槐定堿可明顯提高骨癌痛大鼠的機械痛閾和熱痛閾,并能改善腫瘤引起的骨損傷,抑制腫瘤的發(fā)展,具有明顯的抗癌痛作用；其抗癌痛作用的外周機制可能與下調腫瘤組織環(huán) 氧 酶-2(COX-2) 、 血 管 內 皮生 長 因子 (VEGF) 的表達有關［4］。 本研究旨在探討槐定堿抗癌痛的中樞作用機制,為該生物堿進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 槐定堿 (購自南京景竹生物科技有限公司, 批號 120306, 純度≥98%)；戊巴比妥鈉 (上海化學試劑公司)； 無菌骨蠟 (安徽省第二人民醫(yī)院提供)； 三氯甲烷 (分析純, 浙江迪耳藥業(yè)有限 公司)；Trizol RNA提取 試 劑 盒 (Invitrogen)； 逆 轉 錄 試 劑 盒 (Promega),RT-PCR 引 物(上海生工生物工程公司合成)； 瓊脂糖 (Sigma)。

1.2 實驗動物 清潔級雌性 SD大鼠, 體質量 180～200 g。購 自 浙 江 中 醫(yī) 藥 大 學 實 驗 動 物 中 心?！維YXK(浙)2012-0013】

1.3 細胞株 W256 癌細胞 (腹水癌細胞種鼠購自浙江醫(yī)學科學院,經(jīng)本課題組純化培養(yǎng)所得)。

1.4 主要儀器 高頻乳腺 攝片機 (意大 利產(chǎn))；C3040-ADUS 型光學顯微鏡照像系統(tǒng) (日本 OLYMPUS 公司)； PCR儀 (Techne)； 凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad Gel DocTM EQ170-8060)； ZF-90 型 暗 箱式紫外透射儀 (上海顧村電光儀器廠)； XZC-2B型自控溫度熱板儀 (山東醫(yī)學科學院生產(chǎn))；XZCA型壓力測痛儀 (山東醫(yī)學科學院生產(chǎn))。

2 方 法

2.1 模型復制與篩選 按照本課題組以往的操作方法［5-6］進 行 骨 癌 痛 模 型 的 復 制: 取 40 只 SD大鼠,3%戊巴比妥鈉麻醉后, 用手術刀在左后肢脛骨中上端 切 開皮膚約 1.0 cm, 暴露 脛 骨后, 先用 7號注射器針頭穿刺打孔, 再用5μL微量注射器吸取 3 μL約含 4 ×103個癌細胞的 W256 細胞懸 液注入骨髓腔,針孔立即用無菌骨蠟封住,縫合皮膚切口。 手術后的大鼠置籠中常規(guī)飼養(yǎng) 10 d 后,3%戊巴比妥鈉麻醉,將手術患肢置于高頻乳腺攝片機下攝片觀察,篩選脛骨中上端骨松質有明顯缺損灶的大鼠用作實驗。

2.2 動物分組 將復制成功的 36 只模型大鼠隨機分為槐定堿治療組和模型對照組, 每組18只； 另取同期飼養(yǎng)的 10 只大鼠 (骨髓腔注入等體積生理鹽水)作為正常對照組。

2.3 動物給藥 各組大鼠從手術后第 15 天開始給藥。其中,正常對照組和模型對照組腹腔注射生理鹽水, 槐定 堿 治 療 組 給 予 槐 定 堿 水 溶液 25 mg/kg (相當于槐定堿注射液臨床推薦最大劑量) 腹腔注射, 每天 1 次, 共給藥 10 d。

2.4 標本取材 末次給藥后的大鼠在測量熱痛閾和機械痛閾后斷頭處死,立即剪開背部皮膚,分離出脊椎置冰塊上,組織鉗咬開脊椎骨,暴露脊髓,沿脊髓兩側切斷脊神經(jīng),完整剝離出腰膨大及以上部 分 約 2.5 cm 脊 髓, 迅 速 截 取 腰 膨 大 上 端 約1.5 cm脊髓投 入 液氮凍存, 每 組隨機取 8 個標 本 用于 RT-PCR檢測。

2.5 指標檢測

2.5.1 痛閾檢測 參照文獻 ［5］ 所述方法, 各組動物于造模前、給藥前及給藥末,分別采用熱板法和足趾壓痛法檢測熱痛閾及機械痛閾的變化。

2.5.1.1 熱痛閾檢測 首先將熱板儀溫度調節(jié)至52 ℃ ±0.1 ℃, 然 后將大鼠腳 趾 置 于熱板面上,以出現(xiàn)添后足時所需時間 (s) 作為該大鼠的熱痛閾值。 每只大鼠均測量 2 次, 間隔時間在 3 min 以上,取2次測量均值作為該大鼠熱痛閾值。

2.5.1.2 機械痛閾檢測 將大鼠患肢一側的足掌置于壓力測痛儀壓力針正下方,開啟電動按鈕,以大鼠出現(xiàn)縮足或嘶叫為痛反應標志,并將此時測痛儀所示壓力值 ( ×10 g) 作為該大 鼠 的 機械 痛 閾值。 每只大鼠均測量 2 次, 時間間隔 3 min 以 上,取2次測量均值作為該大鼠的機械痛閾值。

2.5.2 RT-PCR檢 測 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表達

2.5.2.1 引物設計: 引物, 由上海生工有限公司根 據(jù) primer 5.0 軟 件 設 計 合 成 。 ① NR2B引 物: (上游)5'-TGCACAATTACTCCTCGACG-3',( 下游)5'-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3', 擴增產(chǎn)物222bp；②nNOS 引物:(上游)5'-GAATACCAGCCTGATCCATGGAA3',(下游)5'-TCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCATG3', 擴增產(chǎn)物602 bp； ③內參 ( β-actin) 引 物: ( 上 游)5'-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC 3'； (下 游)5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCACAT 3', 擴增 產(chǎn) 物 480 bp。

2.5.2.2 RT-PCR檢測 按照試劑盒說明書所述步驟進行總 RNA提取、 電泳檢測提取質量、 定量及逆轉錄成 cDNA； PCR擴增: 以內參基因 β-actin、 NR2B、 nNOS 的 cDNA為模板, 分別加入擴增反應 體 系 (50 μL):10 ×Reaction Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、 上 下 游 引 物(12.5 pmol/μL) 各 1 μL、 cDNA模 板 1 μL、 Taq DNA Polymerase(5 μ/μL)1 μL、 25mmol/LMgCl22 μL, 采用 ddH20 擴 容 至 50 μL, 置 PCR儀 中 擴增。 PCR擴增條件:94 ℃預變性 5 min 后,94 ℃/ 50 s、55.5 ℃ /50 s、 72 ℃ /1min, 反應循環(huán) 30 次,最后一輪 72 ℃延伸 5 min,10 ℃保存。

2.5.2.3 結 果 分 析 分 別 取 7 μL的 β-actin 和12 μL NR2B、 nNOS 擴增產(chǎn)物在 1.2%瓊脂糖 (含EB 0.5 ng/mL) 上 電 泳 約 35 min,EQ170-8060 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并 掃描,PCR條帶用 Imagepro plus6.0 圖像分析軟件進行灰度半定量分析, 分別以 NR2BmRNA和 nNOSmRNA條帶與內參 β-actin mRNA條 帶 的 積 分 光 密 度 (IOD) 比 值 作 為mRNA的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學處 理 數(shù)據(jù)采 用 SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計分析, 以 “均數(shù) ±標準差 ()” 表示, 多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析 (one-way ANOVA), 組間均數(shù)比較采用 q檢驗, 差異顯著標準為P＜0.05。

3 結 果

3.1 槐定堿對骨癌痛大鼠痛閾的影響

3.1.1 槐定堿對骨癌痛大鼠熱痛閾的影響 與正常組比較, 造模大鼠術后第14天開始熱痛閾值顯著下降 (P＜0.01), 出現(xiàn)熱痛覺超敏, 給予槐定堿治療后, 大鼠熱痛閾值較模型組顯著提高 (P＜0.01), 熱痛覺超敏明顯緩解 (見表 1)。

表1 槐定堿對骨癌痛大鼠熱痛閾的影響 （）Tab.1 Effect of sophoridine on pain thresholds of therm al stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

表1 槐定堿對骨癌痛大鼠熱痛閾的影響 （）Tab.1 Effect of sophoridine on pain thresholds of therm al stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

注: 與正常組比較,*P＜0.01； 與模型組比較,△P＜0.01

組 別 動物數(shù)/只 基礎 痛閾/s 術后 14 d/s (治療前)術 后 25 d/s (治療末) 10 19.1 ±3.8 18.6 ±3.4 19.4 ±4.8模型組 18 18.8 ±2.5 11.8 ±3.8* 10.3 ±5.2*槐定堿組 18 18.9 ±3.6 12.2 ±4.1* 17.8 ±5.4正常組△

3.1.2 槐定堿對骨癌痛大鼠機械痛閾的影響 與正常組比較, 造模大鼠術后第 14天開始機械痛閾值顯著下降 (P＜0.01), 出現(xiàn)明顯機械性痛覺超敏, 經(jīng)槐定堿治療10 d后, 機械痛閾值均較模型組明顯提高 (P＜0.05), 機械痛覺超敏反應顯著改善 (見表 2)。

表2 槐定堿對骨癌痛大鼠機械痛閾壓力值的影響 （）Tab.2 Effect of sophoridine on pain thresholds ofm echanical stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

表2 槐定堿對骨癌痛大鼠機械痛閾壓力值的影響 （）Tab.2 Effect of sophoridine on pain thresholds ofm echanical stim ulation of rats w ith bone cancer pain induced by W 256 cancer cells（）

注: 與正常組比較,*P＜0.01； 與模型組比較,△P＜0.05

組 別 動物數(shù)/只基礎痛閾/kg術后 14 d/kg (治療前)術 后 25 d/kg (治療末) 10 0.301 ±0.037 0.315 ±0.043 0.319 ±0.049模型組 18 0.297 ±0.032 0.258 ±0.041*0.214 ±0.035*槐定堿組 18 0.306 ±0.029 0.261 ±0.046*0.289 ±0.041正常組△

3.2 槐 定 堿 對 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B mRNA和nNOSmRNA表達的影響 與正常對照組比較, 模型對照組大鼠脊 髓組織 NR2B mRNA和 nNOSmRNA相對表達量均有明顯升高 (P＜0.05)； 與模型對照組比較, 槐定堿治療組大鼠脊髓組織 NR2B mRNA和 nNOS mRNA相 對 表 達 量 均 明 顯 下 調(P＜0.05)。 見表 3 及圖 1、 圖 2。

表3 槐 定 堿 對 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B m RNA和 nNOS m RNA表達的影響 （）Tab.3 Effects of sophoridine on on the expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in sp inal cord of ratsw ith bone cancer pain（）

表3 槐 定 堿 對 骨 癌 痛 大 鼠 脊 髓 NR2B m RNA和 nNOS m RNA表達的影響 （）Tab.3 Effects of sophoridine on on the expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in sp inal cord of ratsw ith bone cancer pain（）

注: 與正常對照組比較,*P＜0.05； 與模型對照組比較,△P＜0.05

mRNA表達相對值組 別 給藥劑量 樣本數(shù)NR2B nNOS正常對照組- 8 0.971 ±0.067 1.015 ±0.054模型對照組 - 8 1.325 ±0.024*1.352 ±0.085*槐定堿治療組 25 mg/kg 8 0.915 ±0.087△0.912 ±0.078△

圖 1 NR2B m RNA和 β-actin m RNA RT-PCR擴增 產(chǎn) 物Fig.1 Amplification products of NR2BmRNA andβ-actin m RNA

4 討 論

圖 2 β-actinm RNA和 nNOSm RNA RT-PCR擴 增 產(chǎn)物Fig.2 Am p lification products of β-actin m RNA and nNOSm RNA

研究表明,癌癥痛的發(fā)生與傳統(tǒng)的炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛有相似之處,但又有獨特的發(fā)生發(fā)展機制［7］。 因而, 采 用 傳 統(tǒng) 疼 痛 模 型 對 抗 癌 痛 藥 物進行評價和研究存在明顯的局限性。本實驗采用來源于大鼠乳腺癌組織,具有良好骨侵襲能力的W 256 癌細胞注入大鼠骨髓腔, 成功建立了 骨癌痛模型［8］, 采用 該模型代替 傳 統(tǒng) 疼痛 模 型 對抗 癌 痛藥物進行研究,更加符合臨床實際,研究結果更為可靠。

大量證據(jù)顯示,NMDA受體與脊髓水平傷害性信息的處理以及痛覺過敏的形成和維持密切相關,該受體的表達和激活在病理性痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要作用［9］。目前已知 NMDA受體至少存在 7個亞 基, 包 括 1 個 NR1 亞 基、 4 個 NR2 亞 基(NR2A、 NR2B、 NR2C、 NR2D) 及 2 個 NR3 亞基(NR3A、 NR3B)［10］。 其 中,NR2B亞 基 主 要 分 布于與疼痛傳導密切相關的脊髓背角Ⅰ、Ⅱ層和前腦。 行為學研究發(fā)現(xiàn), 正常動物鞘內注射 NMDA可引起自發(fā)傷害性感受行為,并誘發(fā)動物產(chǎn)生熱痛覺和機械性痛覺過敏； 應用選擇性作用于 NR2B亞基的 NMDA受體拮抗劑可有效緩解大鼠慢性炎癥和神經(jīng)損傷模型中的熱痛覺過敏和機械性觸誘發(fā)痛。 這些結果表明,NR2B亞基在突觸傳遞、 痛覺感知和中樞痛覺敏化形成等方面發(fā)揮了重要的作用, 也間接表明 NR2B亞基可能是藥物鎮(zhèn)痛的新靶點［11-12］ 。

一氧化氮 (NO) 是一種具有極強生物活性的無機小分子,也是一種新型的神經(jīng)遞質,在體內可強化神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞,介導多種神經(jīng)生理和病理過程,尤其在痛覺信號傳導過程中起重要作用。NO水平的變化主要取決于一氧化氮合酶 (NOS)的表達水平及活力, 它是生成 NO的限速酶。NOS有三種亞型, 分別是誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)、 神經(jīng)元型一氧化氮合酶 (nNOS) 和內皮型一氧化氮合酶 (eNOS), 其中 nNOS 是 NO在神經(jīng)系統(tǒng)中生成的關鍵酶。研究發(fā)現(xiàn),坐骨神經(jīng)慢性束縛損傷模型大鼠中脊髓背角 nNOS 活性顯著增加；皮下注入福爾馬林前, 先向髓腔內注入 nNOS 抑制藥, 疼痛行為產(chǎn)生明顯減弱, 表明 nNOS/NO在神經(jīng)病理性性疼痛和炎性痛的形成中發(fā)揮重要作用［13］。一般情況下, 神 經(jīng) 系統(tǒng) 中 NO的 產(chǎn)生 依 賴于 NMDA受體的激活,NMDA受體激活后可以激活 nNOS, 后者可催化 L-精氨酸和氧生成 NO,NO作為鳥苷酸環(huán)化酶 (GC) 的內源性因子, 促進環(huán)鳥苷酸 (cGMP) 的合成, 提高靶細胞內的 cGMP水 平, 形 成 NMDAR-nNOS/NO-cGMP信 號 轉 導 通路,該通路在疼痛調節(jié)和痛覺過敏中發(fā)揮著重要作用［14］。

本研究結果表明,槐定堿能夠顯著提高骨癌痛模型大鼠的熱痛閾和機械性痛閾值 (P＜0.01, P＜0.05), 明顯改善 W 256 癌細胞誘 導 的骨癌痛大鼠痛覺過敏狀態(tài),呈現(xiàn)出較好的抗癌痛作用。對大鼠脊髓 NR2B mRNA和 nNOSmRNA表達檢測結果顯示, 模型組大鼠較正常對照組大鼠脊髓組織NMDA受體 NR2B亞基和神經(jīng)元型一氧化氮合酶 nNOS的 mRNA表達量均有明顯升高 (P＜0.05), 而經(jīng)槐定堿治療后脊髓組織 NR2B和 nNOSmRNA表達量均明顯下調 (P＜0.05), 表明采用 W256 癌細胞誘導的骨癌痛模型的痛覺敏化形成可能與NMDAR-nNOS/NO-cGMP信 號 轉 導 通 路 的 激 活 有關。而槐定堿抗骨癌痛作用的機制可能與抑制該信號轉導通路有關。槐定堿可能是通過下調脊髓NR2B亞基的mRNA表達, 抑制 NMDA受體的表達和激活, 繼而使 nNOS 的表達和 NO的生成減少,最終抑制了腫瘤引起的中樞痛覺過敏的形成。

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Effects of sophoridine on expression of NR2B m RNA and nNOSm RNA in spinal cord of rats w ith bone cancer pain

YAN Ji-gui, WANG Ying-xin, YANG Yu-qing, WANG Ya-jie

(Department of Pharmacy,AnhuiMedical College,Hefei 230601,China)

AIM To explore the effects ofsophoridine onmRNA expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor NR2B subunit and neuronal nitric oxide synthase(nNOS)in spinal cord of ratswith bone cancer pain induced by W256 tumor cells,and their analgesic mechanism.METHODS Forty female Sprague-Dawley rats were used asmodels of bone cancer pain after being injected with W256 tumor cells into the marrow cavity,random ly divided into two groups:sophoridine treated group(25mg/kg sophoridine)andmodel controlgroup.Another ten ratswere selected to be normal control group by injecting normal saline.Before and after the treatment,pain thresholds of thermal stimulation and mechanical stimulation weremeasured.After the treatment,the expression of NR2BmRNA and nNOSmRNA in spinal cord were detected by RT-PCR.RESULTS Sophoridine could obviously increase the thresholds of thermal stimulation and mechanical stimulation in rats with bone cancer pain induced by W256 tumor cells.And it could significantly downregulate the expression of NR2B mRNA and nNOSmRNA in spinal cord of rats with bone cancer pain.CONCLUSION The analgesicmechanism of sophoridine against bone cancer pain may be related to its downregulation of the signal transduction pathway of“NMDAR-nNOS/NO-cGMP”which is closely connected with hyperalgesia.

sophoridine； bone cancer pain； N-methyl-D-aspartate receptor2B subunit(NR2B) ； neuronal nitric oxide synthase(nNOS)

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1142-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.007

2013-11-07

安徽省高等學校省級自然科學研究重點項目 (KJ2012Z203)

嚴繼貴 (1975—), 男, 博士, 副教授, 從事中藥抗癌痛及新藥研究。 Tel:(0551)63818309,E-mail:yanjigui1210@126.com