肖吉元， 程月芳， 李建雄， 白銀亮*

（1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部， 甘肅 蘭州 730030；2.河南省腫瘤醫(yī)院藥學部， 河南 鄭州 450000；3.蘭州大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730030）

[藥 理]

燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞凋亡的保護作用

肖吉元1， 程月芳2， 李建雄3， 白銀亮1*

（1.蘭州大學第二醫(yī)院藥學部， 甘肅 蘭州 730030；2.河南省腫瘤醫(yī)院藥學部， 河南 鄭州 450000；3.蘭州大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 甘肅 蘭州 730030）

目的 觀察燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞凋亡的保護作用, 并探討其作用機制。 方法 采用 MTT法檢測細胞相對存活率, 流式細胞術(shù)檢測凋亡率,DCFH-DA法檢測細胞內(nèi)活性氧水平； Rhodamine123 染色法檢測線粒體膜電位 水 平； Western blot法 檢 測 胞 漿 Cyt-C的 表 達； ELISA法 檢 測 caspase-3 和 caspase-9 酶 活 性 。 結(jié) 果 250 μmol/L MPP+處理 PC12 細胞, 細胞存活率顯著降低, 并明顯誘導細胞產(chǎn)生凋亡。 而經(jīng)燈盞花素 (12.5、 25、 50 μg/L) 預處理, 有效抑制 MPP+誘導的細胞調(diào)亡, 明顯增加 PC12 細胞存活率, 同時使細胞活性氧的增加和線粒體膜電位的降低；并明顯 抑 制胞漿 Cyt-C的 釋 放 和 caspase-3 和 caspase-9 的 高 表 達 。 結(jié) 論 燈 盞 花 素 預 處 理 能 明 顯 提 高 MPP+誘 導 的PC12 細胞損傷的細胞存活率, 其機制可能與抑制細胞線粒體凋亡途徑有關(guān)。

燈盞花素； MPP+； PC12 細胞； 凋亡； 線粒體

帕金森病是一種臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其病理變化主要表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的丟失［1］。 眾多研究表明, 多巴胺能神經(jīng)元的丟失與細胞凋亡有關(guān),尤其認為線粒體功能紊亂和氧化應激在帕金森病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用［2-3］。 因 此, 保 護 神 經(jīng) 元 的 凋 亡 對 帕 金 森病的治療至關(guān)重要。

燈盞花素 (scutellarin) 是從菊科植物短葶飛蓬中提取的黃酮類化合物,具有明顯的擴張腦血管和保護腦缺血作用［4］, 其 注 射 液 已 廣 泛 用 于缺血性心腦血管疾病的治療。近年來研究顯示燈盞花素對血管內(nèi)皮細胞和皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡性損傷具有 明 顯 的 保 護 作 用［5-6］, 但 目 前 對 多 巴 胺 能 神 經(jīng)元作用的研究很少。 本實驗擬以 MPP+誘導 PC12損傷建立體外帕金森病模型,觀察燈盞花素對MPP+誘導的 PC12 細胞凋亡的影響并對其機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株 大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株 (PC12 細胞)購自中科院上海細胞庫。

1.3 儀 器 Accuri C6 流 式 細 胞 儀 (美 國 BD公司)； 全 波 長 Multiskan Spectrum 酶 標 儀 ( 美 國Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 細 胞 培養(yǎng)及分組 用含 有 100 U/mL青 霉素和 100 μg/mL鏈霉素、 10%胎牛血清和 5%馬血清的 DMEM培養(yǎng)基于 37 ℃、 5%CO2條件下培養(yǎng)PC12 細胞。 隔天換液, 待細胞至 80%融合時, 用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代, 待細胞進入對數(shù)生長期時進行實驗。實驗設空白對照組、模型組和燈盞花素預處理組。各組處理如下,模型組:根據(jù)文獻方法［7］加 入 250 μmol/L的 MPP+處 理 細 胞, 建立帕金森病細胞模型；燈盞花素預處理組:根據(jù)文獻 ［6］ 選用燈盞花素 12.5、 25、 50 μg/L預處理細胞 24 h 后 再 加 入 250 μmol/L MPP+； 空 白 對 照組則只加等體積培養(yǎng)基。每組設3個復孔,所有試驗均重復4次。

1.4.2 MTT法檢測細胞存活率 將 PC12 細胞以1 ×104個/孔 接 種 于 培 養(yǎng) 板 中 培 養(yǎng) 24 h 后, 按“1.4.1” 項 所 述 方 法 分 組 處 理, 藥 物 孵 育 24 h,每孔加入 MTT(質(zhì)量 濃 度 為 5 g/L)20 μL, 繼續(xù)孵育4 h, 棄上清液, 每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)100 μL振蕩數(shù)次, 采 用全自 動酶標儀于 570 nm處測定各孔的吸光度值并計算相對細胞存活率。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將 PC12 細胞以 1 ×105個/孔接 種 于 培 養(yǎng) 板 中 培 養(yǎng) 24 h 后 分 別按 “1.4.1”項所述方法分組處理, 藥物孵育24 h,收集細胞, 用經(jīng)預冷的 PBS 洗 2 次, 按照 AnnexineV-FITC/PI試劑盒說明進行染色操作, 采用流式細胞儀檢測并分析細胞凋亡率。

1.4.4 熒 光 探 針 DCFH-DA檢 測 ROS 水 平 將PC12 細胞 以 1 ×105個/孔 接 種于 培 養(yǎng) 板中 培 養(yǎng)24 h后分別按 “1.4.1” 項所述方法分組處理, 藥物孵育 24 h 后, 離 心 收 集 細 胞,PBS 洗 滌 1 次,加入經(jīng)培養(yǎng)基稀釋成 10 μmol/L的 DCFH-DA溶液1 mL 37 ℃ 避 光 孵 育 20 min。 收集 細 胞, 使 用 PBS洗3次,重懸細胞,采用流式細胞儀檢測其熒光強度值。

1.4.5 Rhodamine123 染色法檢測細胞線粒體膜電位 同 “1.4.4” 項所述方法處理細胞后, 加入10 μmol/L Rhodamine123 染液 1 m L 37 ℃ 避光 孵 育30 min。 收集細胞, 使用 PBS 洗滌細胞 3 次, 重懸細胞,利用流式細胞儀檢測其熒光強度值。

1.4.6 Western blot法檢測 Cyt-C的表達 分別收集各 組 細 胞, 加 入 含 有 PMSF的 RIPA 裂 解 液160 μL, 冰浴 30 min, 震 蕩 待 充 分 裂 解 后, 離 心60 min(20 000 ×g,4 ℃), 收 集 上 清, 并 用 BCA法檢測蛋白濃度, 規(guī)定上樣量為 40 μg。 Cyt-C抗體稀 釋 濃 度 均 為 1 ∶300, β-actin 抗 體 稀 釋 濃 度為1 ∶4 000。

教育背景：福州，育英學校，1910-1912年上海圣瑪利醫(yī)院，1912-1916年芝加哥培訓學校，1918年1月至1920年10月

1.4.7 ELISA法檢測 caspase-9 和 caspase-3 酶活性分別收 集各組細胞, 冰浴 裂 解 20 min。 離 心 15 min(16 000 ×g,4 ℃), 取上清, 并 測 定 蛋 白 水平。所有操作均按試劑盒說明書進行。具體如下:反應于96 孔板中進行, 取緩沖液 80 μL, 樣品 10 μL,Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L,caspase-3 底 物 )或 者 Ac-LEHD-pNA(2 mmol/L,caspase-9 底 物) 10 μL, 充分混 勻 后于 37 ℃ 孵育 120 min, 酶 標 儀測定 405 nm波長處吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞存活率的影響 如 圖 1 所 示,250 μmol/L MPP+作 用 24 h后, 細 胞 存 活 率 僅 為 空 白 對 照 組 的 (47.1 ± 5.2)%, 與空白對照組相比, 模型組細胞存活率呈顯著性下降 (P＜0.001)。 燈盞花素預處理能劑量依賴地抑制 MPP+誘導的 PC12 細胞存活率的降低 (P＜0.001)。

圖 1 燈盞花素對 MPP+誘導 的 PC12 細 胞 存 活 率 的 影 響（， n=4）Fig.1 Effect of scutellarin on MPP+-induced cell viability in PC12 cells（， n=4）

2.2 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞凋亡率的影響 250 μmol/LMPP+作用24 h 后細胞凋亡率為(33.1 ±4.9)%, 空 白 對 照 組 凋 亡 率 為 (2.3 ± 0.4)%, 與空白對照組比較, 模型組細胞凋亡率呈顯 著 性 增 加 (P＜0.001)。 而 經(jīng) 燈 盞 花 素(12.5、 25、50 μg/L) 預處理 24 h 后, 細 胞 凋 亡率則明顯降低 (P＜0.01)(見表1)。

表 1 燈盞花素對 MPP+誘導 的 PC12 細 胞 凋 亡 率 的 影 響（， n=4）Tab.1 Effect of scutellarin on the percentage of apoptosis induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

表 1 燈盞花素對 MPP+誘導 的 PC12 細 胞 凋 亡 率 的 影 響（， n=4）Tab.1 Effect of scutellarin on the percentage of apoptosis induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

注: 與空白對照組比較,###P＜0.001； 與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組 別 劑 量 /( μg.L-1) 凋 亡 率 /% 2.3 ±0.4模型組 33.1 ±4.9###燈盞花素 12.5 24.1 ±5.3*燈盞花素 25 16.1 ±4.6*燈盞花素 50 7.5 ±1.3空白對照組**

2.3 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞內(nèi) ROS水平的影響 如表2所示,與空白對照組比較,模型組細胞 DCF熒光強度明顯升高 (P＜0.001),即細胞內(nèi) ROS水平明顯升高。 燈盞花素預處理則能明顯抑制 MPP+誘導的 PC12 細胞內(nèi) ROS 水平的升高 (P＜0.001)。

表 2 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞內(nèi) ROS水平的影響 （， n=4）Tab.2 Effect of scutellarin on the level of ROS induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

表 2 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞內(nèi) ROS水平的影響 （， n=4）Tab.2 Effect of scutellarin on the level of ROS induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

注: 與空 白 對 照 組 比 較,###P＜0.001； 與 模 型 組 比 較,**P＜0.01,***P＜0.001

熒光強度空白對照組組 別 劑 量 /( μg.L-1) DCF 104.2 ±11.7模型組 198.6 ±20.3###燈盞花素 12.5 168.6 ±18.1**燈盞花素 25 151.7 ±12.3**燈盞花素 50 120.4 ±14.4***

2.4 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞線粒體膜電位的影響 如表3所示,與空白對照組比較,模型組細 胞 Rhodamine熒 光 強 度 顯 著 性 降 低 (P＜0.001), 即線粒體膜電位水平明顯降低； 同時,綠色熒光強度明顯增加, 綠色/紅色熒光比值由空白對照組的 (0.8 ±0.2) 增加為 (5.3 ±1.7), 呈明顯的統(tǒng)計學差異 (P＜0.001)。 與模型組比較,燈盞花素預處理能夠抑制 MPP+誘導的 PC12 細胞線粒體膜電位的降低 (P＜0.001)。

表 3 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞線粒體膜電位的影響 （， n=4）Tab.3 Effect of scutellarin on the level of m itochrond ia transmembrane potential induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

表 3 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞線粒體膜電位的影響 （， n=4）Tab.3 Effect of scutellarin on the level of m itochrond ia transmembrane potential induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

注: 與空白對照組比較,###P＜0.001； 與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

熒光比值空白對照組組 別 劑量/ (μg.L-1) Rhodamine熒光強度綠色/紅色1 963.2 ±112.3 0.8 ±0.2模型組 979.1 ±88.6### 5.3 ±1.7###燈盞花素少劑量組 12.5 1 201.4 ±265.7** 3.8 ±1.1*燈盞花素中劑量組 25 1 573.2 ±189.5** 2.5 ±0.9**燈盞花素高劑量組 50 1 795.6 ±201.8*** 1.4 ±0.3***

2.5 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞胞漿 Cyt-C水平的影響 Western blot結(jié)果顯示,MPP+能明顯誘導的 PC12 細胞胞漿 Cyt-C的釋放, 與空白對照組比較, 模 型 組 細 胞 胞 漿 Cyt-C表 達 明 顯 增 加(P＜0.001), 燈盞花素 (12.5、 25、 50 μg/L) 預處理呈劑量依賴地抑制 MPP+誘導的 PC12 細胞胞漿 Cyt-C釋放的增加 (P＜0.01), 結(jié)果見圖 2。

2.6 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細胞 caspase-9和 caspase-3 酶活性的影響 ELISA結(jié)果顯示, 與空白對照 組比較,250 μmol/L MPP+作用 PC12 細胞 24 h 后,caspase-9 和 caspase-3 酶活性均 顯著性升高 (P＜0.001,P＜0.001), 燈盞花素預處理則能 夠 降 MPP+誘 導 的 PC12 細 胞 caspase-9 和caspase-3 酶活性的升高 (P＜0.001,P＜0.01) (見表4)。

圖 2 燈盞花素對 MPP+誘導的 PC12 細 胞胞漿 Cyt-C水平的影響 （， n=4）Fig.2 Effect of scutellarin on the expression of cytosolic Cyt-C induced by MPP+in PC12 cells（， n=4）

表 4 燈 盞 花 素 對 M PP+誘 導 的 PC12 細 胞 caspase-9 和caspase-3 酶活性的影響 （， n=4）Tab.4 E ffects of scutellarin on the activity of caspase-9 and caspase-3 induced by M PP+in PC12 cells（， n=4）

表 4 燈 盞 花 素 對 M PP+誘 導 的 PC12 細 胞 caspase-9 和caspase-3 酶活性的影響 （， n=4）Tab.4 E ffects of scutellarin on the activity of caspase-9 and caspase-3 induced by M PP+in PC12 cells（， n=4）

注: 與空白對照組比較,###P＜0.001； 與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001

組 別 劑量/ (μg.L-1) caspase-9/ (U.mg-1) caspase-3/ (U.mg-1)對照組602.1 ±137.5 350.2 ±109.3模型組 1 496.2 ±466.1###899.6 ±244.5###燈盞花素小劑量組 12.5 1 017.8 ±312.1**701.4 ±178.2*燈盞花素中劑量組 25 903.5 ±247.4**553.7 ±99.8**燈盞花素高劑量組 50 785.6 ±163.8***421.6 ±101.9***

3 討論

PC12 細胞來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤,由于其受體及合成的遞質(zhì)均與中腦多巴胺能神經(jīng)元十分接近,因此常用其代替多巴胺能神經(jīng)元用于帕金森病細胞模型的建立［8-9］。 MPP+為 MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶) 經(jīng)過單胺氧化酶 B催化后產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,可直接被多巴胺能神經(jīng)細胞膜上的單胺轉(zhuǎn)運體攝入胞內(nèi)并進入線粒體,可特異性抑制線粒體復合物-Ⅰ的活性, 并引起線粒體ATP生成障礙和線粒體膜電位下降, 從而導致線粒體 功 能 損 傷［10-12］, 同 時 MPP+誘 導 產(chǎn) 生 大 量 的 ROS, 會進一步損傷線粒體并最終引起細胞死亡［13-15］。 因而 MPP+常作為神經(jīng)毒素被廣泛用于建造帕金森 病 的 體 內(nèi) 和 體 外 模 型［8-9］。 目 前,MPP+誘導建立的 PC12 損傷模型是目前研究帕金森病的最常用的體外模型。

本研究采用 MPP+誘導 PC12 損傷建立體外帕金森病模型, 觀察了燈盞花素對 MPP+誘導的PC12 細 胞 凋 亡 的 影 響。 結(jié) 果 顯 示 250 μmol/L MPP+處理細胞能明顯引起細胞凋亡, 細胞存活率顯著下降, 凋亡率呈顯著增加, 細胞內(nèi) ROS水平明顯升高,線粒體膜電位明顯降低,這均與文獻報道一致［7,12,14-15］, 表 明 模 型 建 立 成 功 。同 時, 本 實驗發(fā)現(xiàn)燈盞花素 (12.5、 25、 50 μg/L) 預處理則能夠有效抑制 MPP+誘導的 PC12 凋亡, 抑制線粒體膜電位的降低和 ROS 水平的升高, 對 MPP+誘導的 PC12 損傷表現(xiàn)出明顯的保護作用。

線粒體功能紊亂和氧化應激在帕金森病的發(fā)病機制中起 著 關(guān) 鍵 作 用［2-3］。 線 粒 體 膜 電 位 的 喪 失 是引起多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡的關(guān)鍵因素之一。本研究結(jié)果顯示燈盞花素預處理能夠有效抑制線粒體膜電位的降低,提示燈盞花素可能直接保護線粒體?；钚匝醯倪^度釋放也是引起引起多巴胺能神經(jīng)元損傷的主要因素之一,本研究結(jié)果顯示燈盞花素預處理能夠有效抑制 ROS水平的升高, 這與文獻報道一致［5-6］。 因此, 不妨認為燈盞花素抑制 PC12凋亡是其保護線粒體膜電位喪失和抑制 ROS過度釋放共同作用的結(jié)果。

線粒體凋亡途徑被認為是細胞凋亡的主要途徑之一［16］。 普遍認為活性氧 自 由 基 等 因 素 誘 導 線 粒體受損后引起線粒體膜電位的降低,引起核膜的破裂 以 及 細 胞 色 素 C等 的 釋 放［17-18］； 進 入 胞 漿 的 細胞色素 C可活化 caspase-9 并進一步激活細胞凋亡過程 中 最 關(guān) 鍵 酶 caspase-3 從 而 觸 發(fā) 凋 亡 級 聯(lián) 反應［19］。 Western blot結(jié) 果 顯 示,MPP+能 明 顯 誘 導的 PC12 細胞胞漿 Cyt-C的釋放, 這與之前報道結(jié)果一致［12］。 而燈盞花素預 處 理 呈 劑 量 依 賴 地 抑 制胞漿的 Cyt-C釋放； 同時,ELISA結(jié)果顯示, 燈盞花素預處理對 MPP+誘導的 PC12 細胞 caspase-9 和caspase-3 的活化同樣具有抑制作用。 因此, 認為燈盞花素抑制 PC12 凋亡機制與其抑制 Cyt-C的釋放和抑制 caspase酶活性有關(guān)。

總之, 燈盞花素預處理能夠有效抑制 MPP+誘導的 PC12 凋亡, 其可能的機制與燈盞花素保護線粒體膜電位喪失和抑制 ROS 過度釋放進而抑制Cyt-C的釋放并最終抑制 caspase-9 和 caspase-3 的凋亡級聯(lián)反應有關(guān)。

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Protective effect of scutellarin on MPP+-induced apoptosis of PC12 cells

XIAO Ji-yuan1, CHENG Yue-fang2, LI Jian-xiong3, BAIYin-liang1*

(1.Department of Pharmacy,Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou 730030,China； 2.Department of Pharmacy,Henan Cancer Hospital, Zhenzhou 450000,China； 3.Department of Internal Neurology,Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou 730030,China)

AIM To investigate the protective effect of scutellarin on MPP+-induced apoptosis of PC12 cells and its related mechanism.METHODS Cell viability and cell apoptotic rate weremeasured by MTT assay and flow cytometry,respectively.The level of reactive oxygen species(ROS)in the cellwas analyzed by fluorometric probe DCFH-DA assay and mitochondria transmembrane potential was tested by Rhodamine123 staining.The expression of cytosolic Cyt-C was analyzed by Western blot.caspase-3 and caspase-9's activities were detected by Enzyme-linked immunosorbent assay.RESULTS Treatmentwith 250 μmol/LMPP+decreased the cell viability and then significantly induced apoptosis in PC12 cells,but pretreatmentwith different concentrations of scutellarin (12.5,25,50 μg/L)increased viability and the ROS level,decreased mitochondria transmembrane potential, halted the release of cytosolic Cyt-C,and enhanced the activity of caspase-3 and caspase-9.CONCLUTION Scutellarin can increase cell viability by preventing MPP+-induced cell apoptosis.Themechanism may be related to the inhibition ofmitochondrial apoptotic pathway.

scutellarin； MPP+； PC12； apoptosis； mitochondria

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1113-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.001

2013-11-17

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金 (lzujbky-2013-216)

肖吉元 (1972—), 男, 副主任中藥師, 研究方向: 中藥藥理學。 E-mail:lzuxjy@163.com

*通信作者: 白銀亮, 男, 醫(yī)學碩士, 研究方向: 藥理學。 Tel:(0931)8942491,E-mail:lzubyl@163.com