于 蓮， 張俊婷， 馬淑霞， 張 濤， 孟德欣

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

山藥多糖提取工藝優(yōu)化及其抗菌活性研究

于 蓮1， 張俊婷1， 馬淑霞2， 張 濤2， 孟德欣2

（1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

目的 優(yōu)化山藥多糖的提取工藝,并對(duì)其進(jìn)行抗菌活性研究。方法 以提取時(shí)間、超聲波功率、提取溫度為自變量,山藥多糖得率為因變量,利用響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖的提取工藝。并采用紙片法對(duì)山藥多糖進(jìn)行抗菌活性研究。 結(jié)果 山藥多糖的最佳提取工藝為提取時(shí)間 108.14min, 超聲波功率 414.66W, 提取溫度 80.54 ℃, 山藥多糖理論提取率為 3.21%, 驗(yàn)證值為 3.154%。 抗菌實(shí)驗(yàn)表明, 山藥多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、 枯草芽孢桿菌、 白色念珠菌屬于中敏感,對(duì)腸炎沙門氏菌屬于低敏感。結(jié)論 采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖的提取工藝方法簡(jiǎn)便,預(yù)測(cè)性好,合理可行。

山藥多糖；提??；響應(yīng)面法；抗菌活性

山 藥 Dioscorea opposita Thunb.又 名 薯 蕷 、 延章、玉延等,為薯蕷科薯蕷屬多年生宿根蔓草植物的干燥塊莖［1］。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué) 研 究 認(rèn)為 山 藥 的藥 理 活性主要成 分是山 藥多糖 (Yam polysaccharide)。提取山藥多糖的方法主要有水溶液提取法、纖維素酶法、 微博 輔 助 法、 超 聲 輔 助 提 取 法［2］。 超 聲 輔 助提取具有增加多糖提取率,節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn),因此本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法［3-4］對(duì)超聲波提取山藥多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立多糖提取條件與提取率之間的模型,以期得到最優(yōu)的工藝,提高多糖得率。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)山藥多糖的研究有很多,有報(bào)道山藥多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、抗突變、 抗氧化等 作 用［5］。 但 關(guān) 于 山 藥 多 糖 的 抗 菌 作用研究尚少,因此,本實(shí)驗(yàn)采用紙片法對(duì)山藥多糖抗菌活性進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究山藥多糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料

FW177 粉碎機(jī) (天津市 泰斯特儀器有限公司)； UV-757 紫外分光光度儀 (上海市棱光精密科學(xué)儀器有限公司)； KQ3200DV型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲波儀器有限公司)； F-A2004 電子分析天平 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司)； LXBIIB低速大 容 量 多 管 離 心 機(jī) ( 上 海 安 亭 科 學(xué) 儀 器廠)； LS—C50L立式壓力蒸汽滅菌器 (江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)； DNR—300 電熱恒溫培養(yǎng)箱(金壇市瑞華儀器有限公司)； ZHJH-C1214B垂直流超凈工作臺(tái) (上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)。

山藥飲片 (安國(guó)市祁?yuàn)W中藥飲片有限公司,由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院劉娟教授 鑒定為懷 山 藥 Dioscorea opposita Thunb； 枯 草 芽 孢 桿 菌 ( 北 京 北 納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院, 批號(hào) CMCC63501)； 金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌、腸炎沙門菌(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度 99.5%, 批號(hào) 110833-201205)； 營(yíng)養(yǎng)瓊 脂、牛肉膏、 蛋白胨均為生物試劑； 95%乙醇、 無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、硫酸,均為分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 提取路線 山藥粉末→95%乙醇回流脫脂→濾渣按1 ∶20 料液比加入蒸餾水→超聲波提取兩次→離心→上清液合并濃縮→95%乙醇沉淀,4℃過夜→離心→干燥后即得山藥多糖［6-8］。

2.2 多糖含量測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品, 蒸餾水配 制 成 0.016、 0.024、 0.032、 0.040、 0.048 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為 縱坐標(biāo), 采 用苯酚-硫酸法［9］繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 制 得 的 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 方 程 為:A=17.050C-0.044 0,r=0.999 3(n=5), 對(duì) 照 品 溶 液 在0.016 ～0.048 mg/L之 間線性 關(guān)系良 好。 精密稱取山藥粗多 糖 10 mg于 100 mL量 瓶 中, 苯酚-硫 酸 法于490 nm處測(cè)定其吸光度, 代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線得山藥多糖樣品濃度,根據(jù)公式計(jì)算得山藥多糖樣品含量。

C—樣品葡萄糖質(zhì)量濃度 (mg/mL),D—樣品溶液稀釋倍數(shù),f—換算因子 (0.9),W—供試品質(zhì)量。山藥多糖樣品多糖含有量為 35.2%。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以山藥多糖提取率為指標(biāo), 采用單因素實(shí)驗(yàn)研究提取溫度、超聲波功率、提取時(shí)間三個(gè)因素對(duì)山藥多糖提取率的影響。

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 確定超聲功率400W, 提取溫度為 80 ℃, 提取時(shí)間分別為40、 60、 80、 100、 120、 140 min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 以 粗多糖提取率為指標(biāo),不同提取時(shí)間對(duì)山藥粗多糖提取率的影響見圖1。 由圖1可知, 山藥粗多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而增加,當(dāng)提取時(shí)間超過到100 min 時(shí), 提取率呈下降趨勢(shì)。

圖1 提取時(shí)間對(duì)山藥粗多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time on extraction yield of polysccharide from yam

2.3.2 超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響 確定提取 溫 度 為 80 ℃, 分 別 以 100、 200、 300、 400、500 W 為超聲功 率 進(jìn) 行實(shí)驗(yàn), 提 取時(shí)間為 100 min,以粗多糖提取率為指標(biāo),不同提取功率對(duì)山藥粗多糖提取率的影響見圖2。 由圖 2可知, 當(dāng)超聲波功率達(dá)到 400 W 時(shí), 山 藥 粗 多 糖 提 取 率 呈 最 大 值,因此, 確定最佳超聲波功率為 400 W。

圖2 超聲波功率對(duì)山藥粗多糖提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide from yam

2.3.3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 確定提取功率為400W, 提取溫度分別為 40、 50、 60、 70、80、 90 ℃, 提取時(shí)間為 100min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 以粗多糖提取率為指標(biāo),不同提取溫度對(duì)山藥粗多糖提取率的影響見圖3。 由圖3可知, 提取溫度對(duì)山藥粗多糖提取率的影響較大,隨著提取溫度的升高,山藥粗多糖提取率也隨著增加, 確定提取溫度80℃為佳。

圖3 提取溫度對(duì)山藥粗多糖提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of polysaccharide from yam

2.4 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)山藥多糖提取條件優(yōu)化

2.4.1 模型的建立與分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)山藥多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到山藥多糖的最佳提取工藝及最大提取率。以提取溫度、超聲波功率、提取時(shí)間為因變量,多糖提取率為指標(biāo), 應(yīng)用 Design-Expert 8.0.5 軟件, 采用Central composite design(CCD) 進(jìn)行實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 。 因素水平表見表1。響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。 響應(yīng)面方差分析結(jié)果見表3。

表1 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimeatal design and resu lts

表3 響應(yīng)面方差分析Tab.3 Analysis of variance for the response sur face

由表3 可知, 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?F值為 30.16,P值小于0.000 1, 表示該模型顯著。 由模型擬合的回歸方程為:Y=3.39-0.15X1+0.13X2+0.055X3-0.049X1X2-0.021X1X3+0.014X2X3-0.21X21-0.18X22-0.25X23,R2=0.964 5。 P＜0.05 的 項(xiàng) 代 表顯著項(xiàng),說明具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由此得到的最佳提取工藝為:提取時(shí)間 108.14min, 超聲波 功 率 414.66 W, 提取 溫 度80.54 ℃, 山藥多糖提取率最大預(yù)測(cè)值為 3.21%。不同因素對(duì)山藥多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖4 ～6。

圖4 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)山藥粗多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Effects of extraction time and extraction temperature on extraction yield of polysaccharide from yam

2.4.2 最優(yōu)條件驗(yàn)證 按照軟件分析得到的最佳提取工藝: 提取時(shí)間 108 min, 超聲波功 率 400W, 提取溫度80 ℃, 進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)五次, 結(jié)果見表 4。 最佳提取工藝驗(yàn)證結(jié)果為 3.154%, 實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差為 1.74%, 結(jié)果比較理想。

圖5 提取時(shí)間和超聲波功率對(duì)山藥粗多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Effects of extraction timeand ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide from yam

圖6 提取溫度和超聲波功率對(duì)山藥粗多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Effects of extraction temperature and ultrasonic power on extraction yield of polysaccharide from yam

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of experimental verification

2.5 提取次數(shù)對(duì)山藥多糖提取率的影響 按照星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取工藝, 提取時(shí)間 108 min, 超 聲波功率 400W, 提取溫度 80 ℃, 以粗多糖得率為指標(biāo)考察提取次數(shù) (1次、2次、 3次、 4次) 對(duì)粗多糖得率的影響, 結(jié)果見圖7。 由圖7可知, 當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí),山藥粗多糖提取率為最高,隨著提取次數(shù)增加山藥粗多糖提取率無(wú)明顯變化,因此實(shí)驗(yàn)確定提取次數(shù)為2次。

2.6 抗菌實(shí)驗(yàn)

2.6.1 菌懸液的制備 將 5 種供試菌接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中,37 ℃ 培 養(yǎng) 24 h(白 色 念 珠 菌 需 26 ℃ 培 養(yǎng)48 h), 調(diào)整菌懸液濃度為 106個(gè)/mL～107個(gè)/mL,備用。

圖7 提取次數(shù)對(duì)山藥粗多糖提取率的影響Fig.7 Effects of extraction times on extraction yield of polysaccharide from yam

2.6.2 抗菌活性測(cè)定 將實(shí)驗(yàn)制得的山藥多糖經(jīng)TCA法除 蛋 白［10-11］、 H2O2法 除 色 素［12］、 透 析 袋 除小分子后配制成 40 mg/mL的 溶液, 備 用。 在 超 凈工作臺(tái)上,分別將培養(yǎng)好的5種菌懸液倒入滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中,混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中,待瓊脂凝固后,用滅菌的小鑷子分別夾取蘸有多糖溶液的濾紙片,置于培養(yǎng)皿中,以滅菌蒸餾水為空白,依據(jù)各菌種培養(yǎng)條件,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每個(gè) 濃 度 重 復(fù) 5 次［13-14］。 測(cè) 定 抑 菌 圈 直 徑, 結(jié) 果 見表5。

表5 山藥多糖抑菌圈直徑 （mm）Tab.5 Antilacterial activity of pulysaccharile from yam

抑菌圈實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn): 抑菌圈直徑大于 20 mm, 極敏感； 15 ～20 mm, 高 敏 感 ；10 ～15 mm,中敏 感； 7 ～9 mm, 低 敏 感； 小 于 7 mm, 不 敏感［15］。由表 5 可知, 山藥多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌屬于中敏感,對(duì)腸炎沙門氏菌屬于低敏感。

3 討論

超聲波可在液體中產(chǎn)生空化作用,而空化作用產(chǎn)生的沖擊波和射流可破壞植物細(xì)胞核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),從而增加細(xì)胞內(nèi)容物通過細(xì)胞膜的穿透力和傳輸能力［16］。 超聲波法提取多糖較傳統(tǒng)熱水法節(jié)約時(shí)間,并降低了提取溫度,可減少高溫對(duì)多糖的影響。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國(guó)內(nèi)外近年來(lái)常用的優(yōu)化提取工藝的方法,具有精密度高,預(yù)測(cè)性好等優(yōu)點(diǎn)。但由于實(shí)驗(yàn)次數(shù)過多,少數(shù)實(shí)驗(yàn)提取率與理論提取率稍有不同,因此需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)以達(dá)到預(yù)期值。本實(shí)驗(yàn)在單因素基礎(chǔ)上, 采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波法提取山藥多糖的工藝,山藥多糖提取率預(yù)測(cè)值為 3.21%, 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為 3.154%, 實(shí) 測(cè)值與預(yù)測(cè)值的偏差為1.74%, 表明此方法預(yù)測(cè)性好。

抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,山藥多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌效果,對(duì)腸炎沙門氏菌的抑菌效果不明顯。此研究為開發(fā)天然抑菌藥物資源提供了理論依據(jù),但還需對(duì)其他致病菌的抑菌效果做進(jìn)一步研究,同時(shí),筆者還將對(duì)山藥多糖的組成及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深一步的研究。

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Optim ization of polysaccharide extraction from yam and its antibiotic activity

YU Lian1, ZHANG Jun-ting1, MA Shu-xia2, ZHANG Tao2, MENG De-xin2

(1.Key University Labaratory of Heilongjiang Province,School of Pharmaceutical Sciences,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China； 2.School of Basic Medical Science,Jiamusi University,Jiamusi154007,China)

polysaccharide from yam； extraction； response surface； antibiotic activity

R284.2

:A

:1001-1528(2014)06-1194-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.018

2013-10-18

國(guó)家自然基金項(xiàng)目 (81274101)

于 蓮 (1961—), 女, 教授, 從事靶向制劑和中藥微生態(tài)制劑研究。 Tel:(0454)8610166,Email:jdyulian@163.com