郜紅利， 涂 星， 盧 映， 孫敏紅， 張 方

（1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院， 湖北 恩施 445000； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州510405；3.湖北省恩施州疾病控制中心， 湖北 恩施 445000； 4、湖北省恩施自治州優(yōu)撫醫(yī)院，湖北 恩施445000）

心腎不交所致失眠大鼠模型

郜紅利1， 涂 星2*， 盧 映2， 孫敏紅3， 張 方4

（1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院， 湖北 恩施 445000； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州510405；3.湖北省恩施州疾病控制中心， 湖北 恩施 445000； 4、湖北省恩施自治州優(yōu)撫醫(yī)院，湖北 恩施445000）

目的 建立同時(shí)符合中醫(yī) “心腎不交” 和下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂的失眠大鼠模型。 方法 采用母乳鼠分離法、 多種焦慮刺激和腹腔注射對氯苯丙氨酸造失眠模型, 并考察受試大鼠的一般行為學(xué)、 血象及血漿 Orexin、 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素 (CRH)、 促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH) 的水平。 結(jié)果 模型組大鼠睡眠時(shí)間顯著減少, 目光呆滯,雙目、口唇呈蒼白色,爪甲較光滑,皮毛重度枯槁蓬亂；血象檢查血漿中紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白水平顯著降低；血漿中 ACTH、 Orexin、 CRH水平顯著性升高。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)的失眠大鼠模 型能體現(xiàn)了 “ 心腎不交” 所致下 丘腦-垂體-腎上腺軸內(nèi)分泌紊亂的失眠發(fā)生特點(diǎn)。

失眠； 心腎不交； 下丘腦-垂體-腎上腺軸； 動(dòng)物模型； 激素分泌

失 眠 (insomnia) 是 指 患 者 對 睡 眠 時(shí) 間 和(或) 睡眠質(zhì)量不滿足并影響白天社會功能的一種主觀體驗(yàn)［1］。 研 究 表 明, 應(yīng) 激 是 導(dǎo) 致 失 眠的 重 要原因, 其 病 理 生 理 基 礎(chǔ) 是 下 丘 腦-垂 體-腎 上 腺 軸(HPA軸) 過于興奮和亢進(jìn),orexin 是一種興奮性神經(jīng)肽激素,有強(qiáng)大的促覺醒效果,在維持覺醒狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用,HPA軸通路分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素 (CRH)、 促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH) 對于應(yīng)激和覺醒狀態(tài)維持也具有重要意義［2-5］。 目前, 由 于 中 醫(yī) 藥 治 療 疾 病 辨 證 論 治 的 特色,缺乏中醫(yī)癥候動(dòng)物模型給研究者帶來了巨大的難題。 本實(shí)驗(yàn)擬采取多因素共同作用制作 “心腎不交” 所致 HPA軸紊亂的動(dòng)物模型, 并對其進(jìn)行評價(jià),以期為后續(xù)研究提供合理科學(xué)的研究對象。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康 SD大鼠窩 鼠 (出生 2 d)3 窩,每窩8只,雌雄不限,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 合格證號:SCXK(粵)2013-0020。 大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為溫度 (20 ±2) ℃, 相對濕度 50% ～70%, 自然光節(jié)律。

1.2 藥物與試劑 對氯苯丙氨酸 (PCPA, 美國sigma公司)； ACTH、 orexin、 CRH 酶 聯(lián) 免 疫 試 劑盒 (R&B公司,U.S.A), 其他試劑均為分析純。

1.3 儀 器 酶 標(biāo) 儀 (MK3 型,Thermo Labsystem公司)； 微量有機(jī)分析專用超純水機(jī) (伊洋企業(yè)發(fā)展有限公司)； 大鼠自主活動(dòng)測試儀 (成都泰盟科技有限公司)； 全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng) BP-100A (成都泰盟科技有限公司)；Anke TGL-16B離心機(jī)；JK5200B超聲波清洗器； 分析天平等。

2 方法

2.1 失眠 動(dòng) 物 模型的制 作［6-7］將 出生 2 d 的 3 窩乳鼠按窩分成兩組,正常組1窩8只,模型組2窩16只, 與母鼠同籠飼養(yǎng)。 模型組第 3 天開始乳鼠與母鼠 每 天分離 180 min, 至 第 21 天 離乳； 第 22天至第35天, 每天對乳鼠隨機(jī)給予刺激: 四肢束縛 2 h、4 ℃ 冰 水 游 泳 5 min、 禁 食 24 h、 禁 水24 h、 夾 尾 1 min、 明 暗 顛 倒 24 h、 電 擊 足 底10 min(電 流 強(qiáng) 度 1 mA, 電 壓 30 V, 每 隔 10 s刺激 1 次, 每 次持續(xù) 1 s, 共 60 次)、 鼠籠傾斜 45° 24 h、 潮濕墊料 24 h 等 10 種 刺 激 隨機(jī) 不 連 續(xù) 地 刺激,每天1種,每種刺激平均出現(xiàn)1～2次,使動(dòng)物不能預(yù)料刺激的發(fā)生； 第 35 ～37 天, 每天上午8∶00—8∶30 按 10 mL/kg用 量 腹 腔 注 射 PCPA液。正常組小鼠前 35 d 不做任何處理, 第 35 ～37 天同時(shí)間等量腹腔注射弱堿性生理鹽水 (pH 7 ～8)。

2.2 模型的評價(jià)

2.2.1 大鼠一般行為學(xué) 通過攝像頭觀察睡眠時(shí)間,正常狀態(tài)下觀察活動(dòng)量、精神狀況、雙目、口唇、 爪甲、 皮毛等。 第 37天觀察比較各組大鼠的體表特征, 并 進(jìn) 行 體 表 特 征 積 分 評 分［7］。 評 分 標(biāo)準(zhǔn):①精神狀態(tài)及對外界的刺激反應(yīng)；②眼睛眼裂變窄,嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、體質(zhì)量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光澤。按照5個(gè)等級進(jìn)行積分,狀態(tài)好的5分,狀態(tài)差為1分,共計(jì)25分。 將大鼠放入自主活動(dòng)儀中, 待小鼠適應(yīng)5 min后, 計(jì) 數(shù) 并 打 印 3 min 內(nèi) 站 立 次 數(shù), 連 續(xù) 2次,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.2 血象 分別于 21、 35、 37 d 將大鼠抓取固定,充分暴露胸部,眼科剪去毛,常規(guī)消毒,以4號針頭注射器選取心搏最強(qiáng)處進(jìn)針,調(diào)整進(jìn)針深淺,緩慢抽動(dòng)注射器,取少許血液,進(jìn)行血象檢查。

2.2.3 心率和收縮壓 大鼠在安靜清醒狀態(tài)下,放置在自 制 透明玻 璃 盒 (12 cm×5 cm×7 cm, 大鼠可前后活動(dòng),不能轉(zhuǎn)身)中,日光燈照射尾部加溫,用全自動(dòng)無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測量大鼠尾動(dòng)脈血壓, 第 21、 第 35、第 37 天每只大鼠平行測定 3次,讀取收縮壓和取心率。

2.2.4 血 漿 ACTH、 orexin、 CRH的 檢 測 第 37天抓取正常組和模型組大鼠各8只,眼眶靜脈叢采血 3 ～4 次, 收 集 靜 脈 血 4 mL,3 000 r/min 離 心5 min, 取 上 清 液, 采 用 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 法 按 照ELISA試劑盒說明書檢測 ACTH、 orexin、 CRH的水平。

2.3 數(shù)據(jù)處理 與分析 采 用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析,計(jì)數(shù)資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示, 組間比較采用 t檢驗(yàn), 以 P＜0.05 為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 以 P＜0.01 為有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般行為學(xué) 造模開始前各組動(dòng)物均睡眠良好,精神狀態(tài),目光有神,雙目、口唇呈粉紅色, 爪甲光滑, 皮毛潤澤, 呈白色。模型 組 37 d,動(dòng)物在睡眠剝奪早期表現(xiàn)為一定的興奮性行為,如活動(dòng)增多,對外界聲、光等刺激敏感；睡眠剝奪中后期行為由興奮逐漸轉(zhuǎn)為抑制狀態(tài),多數(shù)動(dòng)物目光呆滯,雙目、口唇呈蒼白色,爪甲較光滑,皮毛重度枯槁蓬亂,抓取時(shí)反抗劇烈。其體表特征和自主活動(dòng)情況觀察結(jié)果見表1。

表1 大鼠一般行為學(xué)特征變化分析 （， n=8）Tab.1 Behavioral characteristics change analysis of insomnic rats（， n=8）

表1 大鼠一般行為學(xué)特征變化分析 （， n=8）Tab.1 Behavioral characteristics change analysis of insomnic rats（， n=8）

注: 與正常對照組比較,*P＜0.01

內(nèi)大鼠活動(dòng)次數(shù) 大鼠體表特征評分正常對照組組 別 3min 7.10 ±1.524 24.50 ±0.527模型對照組 31.13 ±3.441* 14.63 ±1.188*

3.2 血象檢查結(jié)果 結(jié)果見表 2, 在第 22 天時(shí)外周血紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白水平模型組與正常組無顯著性差異, 但數(shù)值略有降低；在第35天時(shí)模型組與正常組的外周血紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白水平有顯著性差異, 模型組顯著低于正常組； 在第 37 天時(shí),模型組與正常組的外周血紅細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白水平有極顯著性差異,模型組極顯著低于正常組。

表2 不同階段大鼠血象檢查結(jié)果 （， n=8）Tab.2 Blood picture test results of insom nic rats at d ifferent stages（， n=8）

表2 不同階段大鼠血象檢查結(jié)果 （， n=8）Tab.2 Blood picture test results of insom nic rats at d ifferent stages（， n=8）

注: 與正常對照組相較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 紅細(xì)胞總數(shù) /( ×1012.L-1血紅蛋白 /(g.L-1)第22 天 第 35 天 第 37 天 第22 天 第35 天 第37天) 8.52 ±1.38 8.47 ±1.52 8.54 ±1.08 134.52 ±3.67 136.18 ±4.04 142.43 ±3.12模型組 8.31 ±0.98 7.23 ±1.05* 4.57 ±1.36** 129.61 ±2.72 110.31 ±1.75** 89.45 ±2.37正常組**

3.3 大鼠尾血壓值及心率的變化 結(jié)果見表 3,在第22天時(shí)模型組與正常組大鼠收縮壓無顯著性差異,但數(shù)值略有升高,而心率有顯著性差異；在第35天時(shí)模型組與正常組的收縮壓有顯著性差異,心率有極顯著性差異； 在第 37天時(shí), 模型組與正常組的收縮壓和心率均有極顯著性差異,模型組顯著高于正常組。

表3 不 同 階段大鼠 尾 血壓值及 心 率變化結(jié) 果 （， n=8） （1 mmHg=0.133 kPa）Tab.3 Blood pressure and heart rate changes of insomnic rats at different stages（， n=8）

表3 不 同 階段大鼠 尾 血壓值及 心 率變化結(jié) 果 （， n=8） （1 mmHg=0.133 kPa）Tab.3 Blood pressure and heart rate changes of insomnic rats at different stages（， n=8）

注: 與正常對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 收縮壓/mmHg心率 /(次.min-1)第22 天 第 35 天 第 37 天 第22 天 第35 天 第37天正常組114.72 ±19.68 115.97 ±12.56 117.36 ±11.22 381.32 ±33.51 389.27 ±41.37 382.62 ±37.19模型組 128.51 ±12.18* 131.29 ±13.11* 144.82 ±9.59** 389.92 ±42.72* 412.31 ±52.39** 428.67 ±22.42**

3.4 血 漿 ACTH、 orexin、 CRH水 平 結(jié) 果 見 表4, 由表可見, 模型組大鼠血漿中 ATCH、 CRH和orexin 水 平 較 正 常 組 大 鼠 極 顯 著 性 升 高 (P＜0.01)。

表 4 兩 組 大 鼠 血 漿 ATCH、 orexin和 CRH 水 平 分 析（， n=8）Tab.4 ACTH， orexin and CRH in blood betw een the tw o groups（， n=8）

表 4 兩 組 大 鼠 血 漿 ATCH、 orexin和 CRH 水 平 分 析（， n=8）Tab.4 ACTH， orexin and CRH in blood betw een the tw o groups（， n=8）

注: 與正常對照組比較,**P＜0.01

組別 ATCH /(ng.L-1) CRH /(ng.mL-1) orexin /( ×10-3.ng.mL-1) 543.65 ±23.92 16.92 ±2.17 22.66 ±5.72模型組 973.68 ±79.82**31.08 ±1.78** 32.73 ±13.02正常組**

4 討論

現(xiàn)代研究表明,兒童受虐待是一個(gè)常見的可能導(dǎo)致個(gè)體在成人期易患失眠癥的早期應(yīng)激,該個(gè)體伴有持續(xù)的 HPA系統(tǒng)活性增強(qiáng)及皮質(zhì)醇的響應(yīng)性增加［8-9］。 本研 究 中 采 取 母 嬰 分 離 方 法 造 成 幼 兒 期的早期應(yīng)激,發(fā)現(xiàn)其對大鼠一般行為學(xué)及血象無明顯影響,但顯著性增加大鼠的收縮壓、加速心臟搏動(dòng),表明母嬰分離操作可能會導(dǎo)致大鼠心氣虛的癥狀。

在導(dǎo)致失眠的環(huán)境危險(xiǎn)因素中,有一大部分與HPA軸亢進(jìn)有關(guān), 而環(huán)境應(yīng)激所致心理層面反應(yīng)以及生理層面的 HPA軸內(nèi)分泌紊亂是主要原因［10-11］。 本研究 對 HPA軸 中 ATCH、 CRH 的 水 平進(jìn) 行 了 考 察, 發(fā) 現(xiàn) 模 型 組 大 鼠 血 漿 中 orexin、ACTH和 CRH的水平較正常組大鼠極顯著性升高,提示通過多因素刺激可以導(dǎo)致 HPA軸激活, 使CRH、 ACTH合成和分泌增多, 而這些激素分泌量的增加可促使大腦皮質(zhì)或腦干神經(jīng)元覺醒,可能是orexin 促進(jìn)覺醒的機(jī)制之一。

對氯苯丙氨酸是一種 5-HT合成抑制劑, 運(yùn)用PCPA腹腔注射大鼠可以抑制大鼠大腦 5-HT合成,造成 晝 夜 節(jié) 律 小 時(shí), 幾 乎 達(dá) 到 完 全 失 眠［12-13］。 現(xiàn)代研究表明,PCPA誘導(dǎo)的動(dòng)物模型屬于中醫(yī)心腎不交的癥候模型［14］。 本研 究 在 中 醫(yī) 心 腎 不 交 理 論的指導(dǎo)下,采取多因素共同作用制作失眠大鼠模型時(shí)也出現(xiàn)了 HPA軸內(nèi)分泌紊亂的特點(diǎn), 表明該模型能滿足 HPA軸紊亂的相關(guān)機(jī)制和給藥研究的需要。

綜上所述,在早期母嬰分離的基礎(chǔ)上,采用多種物理刺激法結(jié)合腹腔注射 PCPA剝奪睡眠法制作 HPA軸紊亂的失眠大鼠模型, 較成功的模擬出失眠的相關(guān)癥候,這為探索失眠發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ),也為治療失眠的中藥新藥開發(fā)提供了更加科學(xué)合理的動(dòng)物模型。但本研究缺乏對該失眠動(dòng)物模型進(jìn)行藥物反證,尚有待進(jìn)一步研究和探討。

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Ratmodel for insomnia caused by heart-kidney imbalance

GAO Hong-li1, TU Xing2, LU Ying2, SUN Min-hong3, ZHANG Fang4

(1.Institute of Traditional ChineseMedicine,Hubei Institute for Nationalities,Enshi445000,China； 2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,China； 3.The Enshi Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000,China； 4.Special Care Hospital of Enshi,Enshi445000,China)

AIM To establish a ratmodel for insomnia that was consistentwith both heart-kidney imbalance and disorder of hypothalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis.METHODS Maternal separation,multiple anxiety stimulation,and the abdominal administration of chlorophenylalamine were adopted to induce rats with insomnia. The general behavior of rats was observed and their hemogram and the levels of ACTH,orexin,CRH were measured.RESULTS Compared to the control group,the rats in the model group showed sleep-less,glassy-eyed, pale lips,and withered fur.The number of red blood cells and the hemoglobin concentration in plasma decreased significantly aswell,while the level of ACTH,orexin and CRH significantly increased.CONCLUSION The insomnia rats can present the symptom of heart-kidney imbalance and dysfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal axis.

insomnia；heart-kidney imbalance；hypothalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis； animalmodel；hormone secretion

R285.5

:A

:1001-1528(2014)06-1138-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.006

2013-10-12

郜紅利 (1967—), 男, 副教授, 研究方向: 民族藥物的開發(fā)與利用。 E-mail:349523825@qq.com

*通信作者: 涂 星 (1987—), 男, 博士生, 研究方向: 中藥藥理學(xué), 藥物制劑新劑型與新技術(shù)。 E-mail:kuangsheng1234@126.com