莊文婷， 朱路平， 向 誠(chéng)， 何 靜， 李 鵬， 李寶才*

（1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 2.澳門大學(xué) 中華醫(yī)藥研究院 中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 澳門 000856）

甘西鼠尾草中丹參二醇B抑制血管新生活性研究

莊文婷1， 朱路平1， 向 誠(chéng)1， 何 靜1， 李 鵬2*， 李寶才1*

（1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 2.澳門大學(xué) 中華醫(yī)藥研究院 中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 澳門 000856）

目 的 研究 丹 參二醇 B的抑制 血 管新生活 性 。 方法 采用硅膠 柱 色譜和 Sephadex LH-20 柱 色 譜等分離 手 段 從甘西鼠尾草丙酮提取物中分離得到丹參二醇 B, 并通過(guò)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、 遷移及其促血管生長(zhǎng)因子的測(cè)定實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)丹參二醇B的體外抑制血管新生作用,以雞胚尿囊膜為體內(nèi)模型對(duì)丹參二醇B抑制血管新生活性進(jìn)行研究。結(jié)果 丹參二醇B對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及其促血管生長(zhǎng)因子的分泌、雞胚尿囊膜血管生成都呈現(xiàn)出劑量依賴型的抑制作用。結(jié)論 丹參二醇B具有抑制血管新生活性,可作為潛在的血管新生抑制劑得以開發(fā)和應(yīng)用。

甘西鼠尾草； 丹參二醇B； 內(nèi)皮細(xì)胞； 雞胚尿囊膜

血管新生是指從已有血管發(fā)芽生成新的血管,它是體內(nèi)一個(gè)重要的生理和病理過(guò)程,正常情況下,其促進(jìn)和抑制處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),只發(fā)生在胚胎形成、傷口愈合以及婦女生理周期等幾個(gè)過(guò)程［1］。然而, 一 旦 這 種 平 衡 被 打 破, 就 會(huì) 伴 隨 很多疾病的出現(xiàn)以及免疫系統(tǒng)的紊亂。尤其是當(dāng)體內(nèi)存在的血管新生促進(jìn)因子超過(guò)了血管新生抑制因子,平衡就會(huì)偏向于新血管的生成,從而可能導(dǎo)致癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性失明、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等嚴(yán)重 疾 病 的 發(fā) 生［2］。 因 此, 從 天 然 植 物 或草藥中去尋找具有血管新生抑制功能的活性低分子化合物成為新藥研究的一大熱點(diǎn)。

丹參二醇 B(tanshindiol B) 為唇形科鼠尾草屬弧隔鼠 尾 草 亞 屬 植 物 甘 西 鼠 尾 草 Salvia przewalskii Maxim中分離得到的二萜醌類化合物, 其具有抗腫瘤 (A549、 SK-OV-3、 SK-MEL-2、XF498 和 HCT-15)［3］, 抗人型結(jié)核分支桿菌和缺血后心肌收縮恢復(fù)作用［4］, 其是否具有抗血管新生活性, 尚未見報(bào)道,為此對(duì)其進(jìn)行了初步的藥效學(xué)研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥材 甘西鼠尾草藥材于 2010 年 8 月采自云南省麗江市,由云南省中醫(yī)中藥研究院郭世民研究員鑒定為唇形科植物甘西鼠尾草。樣本現(xiàn)存于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院天然產(chǎn)物制藥實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 細(xì) 胞 株 及 雞 胚 人 臍 靜 脈 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 株(HUVEC) 購(gòu) 自 于 ScienCell Research Laboratories,試驗(yàn)用雞胚購(gòu)于昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 BRUKER AM-400MHz超導(dǎo)核磁共振儀； AutoSpec Premier P776 雙 聚 焦 三 扇 型 磁 質(zhì)譜儀； Agilent1200 高效液相色譜儀； Sephadex LH-20(20 ～ 100 μm,Pharmacia Fine Chemical Co., Ltd.)； MCI gel CHP20P(75 ～ 150 μm,Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)； Rp-18(40 ～ 50 μm, Merk Co.,Ltd)； 柱 層 析 硅 膠 (200 ～ 300 目)、薄層層析硅膠 (GF254) 均為青島海洋化工廠產(chǎn)品； 酶標(biāo)儀 (Corona Co.Ltd,Ibaraki,Janpan)； 移液槍 (SelectPette) 、 CO2培 養(yǎng) 箱 (Thermo)、 倒 置顯微鏡 (江南)、 96 孔板、 6 孔板。

1.1.4 試驗(yàn)試藥 84 消毒液、 新潔爾滅消毒液、75%乙醇消毒液、 生理鹽水、地塞米松注射液(云南白藥集團(tuán))、 PBS 緩沖液、 甲醇 (分析純)、丙酮 (分析純)、 ECM1001 培養(yǎng)基 ( 購(gòu)自 ScienCell Research Laboratories)、 heat-inactivated FCS(購(gòu) 自GIBCO公司)、P/S( 購(gòu) 自 GBICO公 司)、amphotericin-B(購(gòu)自 GIBCO公司)、 heparin( 購(gòu) 自 上 海浩然生物有 限公 司)、 gelatin( 購(gòu) 自 Sigma公 司)、噻唑藍(lán) (MTT)( 購(gòu)自 Sigma公司)、 DMSO(購(gòu)自Sigma公司)、 VEGF ELISA 試 劑 盒 ( 購(gòu) 自 Invitrogen,Camarillo,CA)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 干燥甘西鼠尾草 (全草) 藥材7.3 kg, 粉碎 后 過(guò) 60 目 篩, 用 100%丙 酮 (每 次20 L) 室溫下 超 聲 提 取 3 次, 每 次 2 h, 提 取 液 減壓濃縮得粗浸膏 300 g。 所得浸膏經(jīng)硅膠柱 色譜石油醚-乙酸乙酯梯度 (1 ∶0、9 ∶1、 3 ∶1、1 ∶1、3 ∶7) 洗 脫,TLC檢 測(cè) 合 并 得 5 個(gè) 部 分 Fr.1 ～Fr.5。 Fr.3(52 g) 經(jīng) MCI柱 層 析 MeOH-H2O (65%、 75%、 85%) 梯度洗脫,75%MeOH-H2O洗脫部分經(jīng)硅膠柱層析, 石油醚-乙酸乙酯梯度(10 ∶1、5 ∶1、2 ∶1) 洗脫, 其中石油醚-乙酸乙酯 (10 ∶1) 洗脫液中有紅色針狀結(jié)晶析出, 吸除母液, 將所 得紅 色 結(jié) 晶 經(jīng) Sephadex LH-20 柱 色 譜純化得到單體化合物 32 mg。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍帶靜脈細(xì)胞 (HUVEC) 培養(yǎng)基采用添加了 10% 胎牛血清 (FCS),1% 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (ECGS),1% 肝素鈉,1%P/S 的ECM1001 培養(yǎng) 基, 將人臍靜 脈 內(nèi) 皮細(xì)胞放置 于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng), 隔天更換培養(yǎng)基, 細(xì)胞密度長(zhǎng)至 70%后每天更換培養(yǎng)基直至細(xì)胞密度長(zhǎng)至 90%, 進(jìn)行傳代操作, 確保細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 噻唑藍(lán) (MTT) 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞, 制成一定濃度的細(xì)胞懸液, 以每孔3 000 個(gè)細(xì)胞的密度, 將細(xì)胞接種于 96 孔板中, 將96 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h,24 h 后觀察 細(xì) 胞生長(zhǎng)狀態(tài), 細(xì)胞生長(zhǎng)正常的情況下, 將 96 孔板上的細(xì)胞分組, 每組 8 個(gè)復(fù) 孔, 將 含 有 不 同 質(zhì) 量 濃 度 (0.5、 1.0、 2.5、5.0、10.0 μg/mL) 丹 參二醇 B( 丹參二醇 B用DMSO配制, 加入細(xì)胞培養(yǎng)基中的 DMSO終濃度小于 0.1%) 的培養(yǎng)基 180 μL加入各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中,以地塞米松 (5.0 μg/mL) 作為陽(yáng)性對(duì)照, 空白對(duì)照組中每孔加入等量常規(guī)培養(yǎng)基。 給藥后在37℃, 5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)72 h, 然后每 孔 加 入 10 μL MTT(5 mg/m L),37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育 4 h 后, 將 96 孔 板 中 的 上 清液小心移除, 每孔加入 150 μLDMSO, 振蕩 10min后, 在酶標(biāo)儀 490 nm下讀取吸光度。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,制成一定密度的細(xì)胞懸液,以每孔5.5 ×105個(gè)細(xì)胞的密度將 HUVEC細(xì)胞接種于 6 孔板中, 將 6 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī) 培 養(yǎng)24 h,24 h 后觀察細(xì)胞 生 長(zhǎng)情況, 待細(xì)胞在6孔板底部生長(zhǎng)形成一層無(wú)間隙的單細(xì)胞層時(shí), 將上清液完全移除, 用 PBS 清洗細(xì)胞表面兩次, 用200 μL的槍頭在細(xì)胞層上豎直劃一道痕,顯微鏡下拍照, 加入含有質(zhì)量濃度為 5.0 μg/mL丹參二醇 B的 培 養(yǎng) 基 2.5 m L, 空 白 對(duì) 照 組 中 每 孔加入等量常規(guī)培養(yǎng)基。將 6孔板置于 37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h, 完全移除上清液, 顯微 鏡 下 拍 照。 用 Image Pro Plus(IPP,version5.1,Media Cybernetics) 圖 像 分 析 軟 件 對(duì) 給 藥前后的照片進(jìn)行圖像分析,進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定 (ELISA) 實(shí)驗(yàn) 通過(guò) ELISA實(shí)驗(yàn), 檢測(cè) HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF) 的密度, 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞, 制成一定密度的細(xì)胞懸液, 以每孔2.0 ×105個(gè)細(xì)胞的密度將 HUVEC細(xì)胞接種于 6 孔板中, 將 6 孔板置于 37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24 h, 細(xì)胞生長(zhǎng)正常的情況下, 移除培養(yǎng) 基, 加 入 含 有 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為 2.5、 5.0、10.0 μg/mL丹參二醇 B的 培養(yǎng)基 2.5 mL, 以地塞米松 (1 mg/m L) 作 為 陽(yáng)性對(duì)照, 空 白對(duì)照組 中 每孔加入等量常規(guī)培養(yǎng)基, 然后將6孔板置于37 ℃, 5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn) 行常規(guī) 培養(yǎng) 72 h, 收 集細(xì)胞培養(yǎng)基, 放 入離心機(jī)中 離 心 1 min(1 000 r/min),收集上清液, 用人 VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的 VEGF進(jìn)行定量分析。

1.2.6 雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn) 采用雞胚尿囊膜做為體內(nèi)模型來(lái)測(cè)試丹參二醇B對(duì)血管新生的影響。取新鮮種雞蛋在溫度為 37.8 ℃,5%CO2, 濕度適宜的條件下 孵 育 7 d, 在 氣室 端 開 窗 (1 cm×1 cm),用直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙片作為給藥載體,實(shí)驗(yàn)組在濾紙片上滴加用無(wú)水乙醇將丹參二醇B配制成 5.0、 10.0 mg/L兩種質(zhì)量濃度的藥液各 20 μL,在超凈臺(tái)中將無(wú)水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在無(wú)菌濾紙片上滴加20 μL生理鹽水?？瞻捉M在濾紙片上加 20 μL無(wú)水乙醇, 在超凈臺(tái)中將無(wú)水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在無(wú)菌濾紙片上滴加20 μL生理鹽水。 陽(yáng)性對(duì)照藥組 (地塞米松組)在濾紙片上加20 μL無(wú)水乙醇, 在超凈臺(tái)中將無(wú)水乙醇揮干,放置于尿囊膜上,然后在濾紙片上滴加20 μL地塞米松。 每組用 8 只雞胚, 完成給藥操作后,用無(wú)菌透明膠帶封窗,在上述條件下繼續(xù)孵育72 h, 向給藥部位滴加固定液 (甲醇-丙酮 =1 ∶1)對(duì)血管做固定處理 15 min, 取下尿囊膜組織, 對(duì)尿囊膜組織表面血管用數(shù)碼相機(jī)微距拍照, 用 Image Pro Plus(IPP,version 5.1,Media Cybernetics) 圖像分析軟件對(duì)圖片中血管面積進(jìn)行計(jì)算［5］。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 CAM血管面積計(jì)數(shù)通過(guò) IPP軟件計(jì)算得到,根據(jù)血管顏色與尿囊膜組織顏色的區(qū)別, 利用 IPP軟件濾鏡處理技術(shù), 增強(qiáng)顏色對(duì)比,通過(guò)采集圖像上的不同色彩點(diǎn)數(shù)來(lái)計(jì)算得到血管面積； 得到的血管面積數(shù)據(jù)用 SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件處理, 得到t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化 合 物結(jié)構(gòu)鑒定 根據(jù)化合 物 的 理 化 性質(zhì)、1H-NMR、13C-NMR以 及 質(zhì) 譜 數(shù) 據(jù), 對(duì) 照 文 獻(xiàn)［6］, 鑒定化合物為丹參二醇 B, 其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 丹參二醇B的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chem ical structu re of tanshindiol B

丹參 二 醇 B 紅 色 粉 末 ( 吡 啶),C18H16O5, ESI-MS m/z:313 ［ M+H］+；1H-NMR(400 MHz, C5D5N) δ:2.14(2H,m,H-1),3.35(2H,m,H-2),3.98(1H,dd,J=4.4,2.9 Hz,H-3),8.03 (1H,d,J=8 Hz,H-6),7.66(1H,d,J=8 Hz, H-7),7.44(1H,s,H-16),1.50(3H,s,Me-17), 2.27(3H,s,Me-18)；13C-NMR(100 MHz, C5D5N) δ:28.5(C-1),28.1(C-2),73.8(C-3), 74.3(C-4),142.3(C-5),133.9(C-6),121.1 (C-7),128.7(C-8),126.5(C-9),150.1(C-10),183.4(C-11),175.9(C-12),120.9(C-13), 161.3(C-14),120.6(C-15),142.2(C-16),8.86 (C-17),25.5(C-18)。

2.2 噻唑藍(lán) （MTT） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 丹參二醇B在一定質(zhì)量濃度下具有抑制HUVEC細(xì)胞增殖的活性,如圖2所示,丹參二醇B質(zhì)量濃度為 0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10.0 μg/mL時(shí),HUVEC細(xì)胞 的 增 殖 抑 制 率 分 別 為 -2.01%、 6.01%、17.10%、 63.77%、 83.4%, 陽(yáng)性組細(xì)胞增殖抑制率為 58.09%, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)?shù)⒍?B質(zhì)量濃度為 5.0 μg/mL時(shí), 其抑制細(xì)胞增殖效果與陽(yáng)性藥效果相近, 說(shuō)明丹參二醇 B有抑制 HUVEC增殖的作用。

圖2 不同質(zhì)量濃度的丹參二醇 B對(duì) HUVEC增殖抑制率影響Fig.2 Affect of tanshindiol B on the proliferation inhibition ratio of HUVEC

2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞劃痕的方法測(cè)試丹參二醇 B對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響, 丹參二醇 B質(zhì)量濃度為 5.0 μg/mL, 作用 HUVEC細(xì)胞24 h后, 細(xì)胞遷移率為 (10.7 ±2.5)%, 空白組中細(xì)胞遷移率為 30.2% ±1.32%, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丹參二醇B有明顯抑制細(xì)胞遷移的作用。

2.4 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 劑 測(cè) 定 （ enzyme-linked immunosorbent assay ELISA） 實(shí) 驗(yàn) HUVEC細(xì) 胞 培 養(yǎng) 基中 VEGF的濃度采用 ELISA的方法測(cè)定。 丹參二醇B 3 個(gè)質(zhì)量濃 度 實(shí)驗(yàn)組的吸 光 度 值 分 別 (0.416 ± 0.09)、 (0.230 ±0.06)、 (0.112 ±0.07), 空白組吸光度值為 (0.496 ±0.05), 陽(yáng)性對(duì)照組吸光度值為 (0.225 ±0.4), 根 據(jù) 實(shí) 驗(yàn) 所 得 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線(Y=519.1 X2-98.86 X+39.86,R2=0.996； X代表吸光度,Y代表 VEGF質(zhì)量濃度), 可以計(jì)算出,丹參二醇 B給藥質(zhì)量濃度分別為 2.5、 5.0、 10.0 μg/mL時(shí), 細(xì)胞培養(yǎng)基中 VEGF的質(zhì)量濃度分別為 886.0、 446.1、 353.3 pg/mL, 空 白 組 中 VEGF質(zhì)量濃度 為 1 185.6 pg/m L, 陽(yáng) 性 對(duì) 照 組 中 VEGF質(zhì)量濃度為 439.6 pg/mL, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 隨著丹參二醇B質(zhì)量濃度的增加, 培養(yǎng)基中VEGF的質(zhì)量濃度明顯下降, 當(dāng)?shù)⒍?B質(zhì) 量濃度達(dá)到 5.0 μg/mL時(shí), 培養(yǎng)基中 VEGF的質(zhì)量濃度與陽(yáng)性對(duì)照組培養(yǎng)基中 VEGF的質(zhì)量濃度相當(dāng), 卻遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組,說(shuō)明丹參二醇B在一定質(zhì)量濃度下具有抑制 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)基中 VEGF的水平。 見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度的丹參二醇 B對(duì) HUVEC分泌 VEGF的影響 （n=3，）Tab.1 Affect of tanshindiol B on the expression of VEGF on HUVEC（n=3，x±）

表1 不同質(zhì)量濃度的丹參二醇 B對(duì) HUVEC分泌 VEGF的影響 （n=3，）Tab.1 Affect of tanshindiol B on the expression of VEGF on HUVEC（n=3，x±）

注: 與空白對(duì)照組比較,*P＜0.005

組 別 質(zhì)量濃度/(μg.mL-1) 吸光度值 VEGF質(zhì)量濃度/(pg.mL-1)丹參二醇B 2.5 0.416 ±0.09 886.0 5.0 0.230 ±0.06 446.1*10.0 0.112 ±0.07 353.3*地塞米松 10.0 0.225 ±0.40 439.6*空白0.496 ±0.05 1185.6

2.5 雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)對(duì)丹參二醇B對(duì)體內(nèi)血管新生的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4、 表2所示, 丹參二醇 B劑量為 100 ng/蛋時(shí), 尿囊膜 血管生長(zhǎng)稀疏, 血管有明顯斷裂,與空白組相比,其血管新生抑制率為67.9%, 丹參二醇 B劑量為 200 ng/蛋時(shí), 尿囊膜血管幾乎不生長(zhǎng),給藥區(qū)域周邊血管稀疏,與空白組相比, 其血管新生抑制率為 72.0%, 此時(shí), 丹參二醇B對(duì)尿囊膜血管新生的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥效果相當(dāng),由此得出結(jié)論:丹參二醇B在一定劑量下可以顯著抑制雞胚尿囊膜血管新生。

3 討論

體內(nèi)血管異常新生能夠?qū)е掳┌Y、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性失明、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等嚴(yán)重疾病的發(fā)生,尤其與癌癥的發(fā)生有著密切的聯(lián)系,因?yàn)槊?xì)血管在為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及運(yùn)輸腫瘤細(xì)胞 代 謝 產(chǎn) 物 方 面 扮 演 著 重 要 的 角 色［7-8］, 因此,血管新生抑制劑成為治療癌癥的一種新策略［9-10］。 例如, 美國(guó) Genentech 公司歷時(shí) 10 年研發(fā)的抗癌藥物 Avanstin 就是一個(gè)血管新生抑制劑。 然而, 目前已上市的和正在進(jìn)行 I-IV期臨床的血管新生抑制劑主要 是 抗 體 藥 物［11］, 抗 體 雖 然 具 有 定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),但是必須采用靜脈注射的方式給藥,相比之下生產(chǎn)成本低、價(jià)格便宜、可口服的低分子藥物理所當(dāng)然地應(yīng)受到醫(yī)療一線的歡迎。近年來(lái),許多學(xué)者也致力于從植物中尋找能夠調(diào)控血管新生的藥物。

圖3 丹參二醇 B對(duì) HUVEC細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 A ffect of tanshindiol B on them igration ability of HUVEC

圖4 丹參二醇 B的 CAM標(biāo)本Fig.4 Picture specimens of CAM with tanshindiol B

表2 丹參二醇 B對(duì)雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)的抑制作用 （n= 8，）Tab.2 Inhibition of vascular grow th on CAM by tanshindiol B（n=8，）

表2 丹參二醇 B對(duì)雞胚尿囊膜血管生長(zhǎng)的抑制作用 （n= 8，）Tab.2 Inhibition of vascular grow th on CAM by tanshindiol B（n=8，）

注: 與空白對(duì)照組比較,***P＜0.001

組 別 劑量/ (ng.蛋-1) 血管面積值 抑制率/%丹參二醇 B 100 110 ±61***67.9 200 96 ±16*** 72.0地塞米松 200 92 ±20*** 73.1空白343 ±72

本研究中丹參二醇B從甘西鼠尾草中首次分離得到, 并分別利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)和雞胚尿囊膜 (CAM) 兩個(gè)體外和體內(nèi)模型, 對(duì)其抑制血管新生活性進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參二醇 B對(duì) HUVEC的增殖、遷移以及分泌促血管生長(zhǎng)因子 (VEGF) 的能力都有較好的抑制作用, 同時(shí)在CAM模型上也表現(xiàn)出一定的抑制血管新生活性,這些研究結(jié)果對(duì)其成為潛在的血管新生抑制劑,并進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。但是其構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)理還有待于做進(jìn)一步深入研究,以為其成為臨床強(qiáng)效血管新生抑制劑提供前期基礎(chǔ)。

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Tanshindiol B from Salvia przewalskii inhibits angiogenic activity

ZHUANGWen-ting1, ZHU Lu-ping1, XIANG Cheng1, HE Jing1, LIPeng2*, LIBao-cai1*

(1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Scienceand Technology,Kunming 650500,China； 2.State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine,Institute of Chinese Medical Sciences,University of Macau,Macau 000856,China)

AIM To study the effect of tanshindiol B from Salvia przewalskii Maxim.on angiogenic activity. METHOD Tanshindiol Bwas isolated from acetonic extractof S.przewalskii and purified by the silica gel column and Sephadex LH-20 column chromatography.MTTmethod was employed to explore the effect of tanshindiol B on themigration and the expression of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)and tomeasure the vascularendothelial growth factor(VEGF)level.The chicken chorioallantoicmembrane(CAM)modelwas used for in vivo inhibition of angiogenic activity.RESULTS Tanshindiol B could inhibit the proliferation and migration of HUVEC,angiogenesis on CAM,and the secrete of VEGF in a dose-dependentmanner.CONCLUSION Tanshindiol B possesses the anti-angiogenic activity,so it can be a promising candidate for angiogenesis inhibitors.

Salvia przewalskii Maxim； tanshindiol B； human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)；chicken chorioallantoic membrane(CAM)

R966

:A

:1001-1528(2014)06-1146-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.008

2013-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30960042)； 云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃 (2009ZC047M)

莊文婷 (1988—), 女, 碩士生, 研究方向: 中藥化學(xué)成分活性研究。 Tel:(0871)65920738,E-mail:zhuangwenting617@ 163.com

*通 信作 者: 李 鵬 (1978—), 男, 助理 教授, 博士, 研 究 方 向: 中 藥 活 性 評(píng) 價(jià) 及 質(zhì) 量 控 制。 Tel:15363569526,E-mail:pli1978@ hotmail.com李寶才 (1957—), 男, 教授, 博士, 研究方向: 天然產(chǎn)物醫(yī)藥開發(fā)。 Tel:15912531421,E-mail:baocaili@hotmail.com