史小媛， 劉 偉， 張 磊， 李淑萍， 程雪梅，2， 習(xí) 陽(yáng)， 王長(zhǎng)虹，2*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)價(jià)國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，上海 201203；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心， 上海 201203； 3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

[制 劑]

駱駝蓬總生物堿中駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究

史小媛1， 劉 偉1， 張 磊1， 李淑萍1， 程雪梅1，2， 習(xí) 陽(yáng)3， 王長(zhǎng)虹1，2*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)價(jià)國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，上海 201203；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心， 上海 201203； 3.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

目的 研究駱駝蓬總生物堿中駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其活性代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇和駱駝蓬酚在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。 方法 口服駱駝蓬總 生物堿 (140 mg/kg) 及靜脈 注射駱 駝 蓬堿與去 氫 駱駝蓬堿 的 混合溶液 (均為3.3 mg/kg), 采集不同時(shí)間點(diǎn)的血漿, 采用 UPLC-MS/MS 法測(cè)定大鼠血漿中駱駝蓬堿、 去氫駱駝蓬堿、 駱駝蓬醇、 駱駝蓬酚的血藥濃度,并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 灌胃和靜脈給藥后,在血漿中檢測(cè)到駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬醇和駱駝蓬酚, 但駱駝蓬酚的血藥濃度在 24 h時(shí)未下降而未能計(jì)算藥動(dòng)參數(shù)。 靜注給藥后, 駱駝蓬堿、 去氫駱駝蓬 堿 和駱駝蓬 醇 的 t1/2e分 別 為 2.554、 3.116、 1.899 h,MRT分 別 為 1.700、 1.311 、 1.880 h,AUC0-t為 373.1、2033.0、 8.914 ng.h/mL。 口 服 總 生 物 堿 后 駱 駝 蓬 堿、 去 氫 駱 駝 蓬 堿 和 駱 駝 蓬 醇 的 Cmax分 別 為 347.6、 184.5、32.7 ng/mL,Tmax分別為 3.200、 1.150、 0.300 h,t1/2e分 別 為 6.994、 5.625、 21.912 h,MRT分 別 為 8.588、 9.791 、27.780 h,AUC0-t為 2 755.5、 1 202.8、 129.8 ng.h/mL?？诜?總 生物堿后 駱 駝蓬堿和 去 氫駱駝蓬 堿 的絕對(duì)生 物 利 用度分別為 63.22%和 4.96%。 結(jié)論 口服總生物堿后駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿均可迅速吸收并迅速代謝, 駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿相比較,具有更高的生物利用度,代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇和駱駝蓬酚與原型駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿相比較,消除速率相對(duì)較慢。此外,靜注給藥后,體內(nèi)去氫駱駝蓬堿的初始血藥濃度明顯高于駱駝蓬堿。

駱駝蓬；總生物堿提取物；去氫駱駝蓬堿；駱駝蓬堿；代謝產(chǎn)物；藥代動(dòng)力學(xué)

駱駝 蓬 Peganum harmala L.為 蒺 藜 科 (Zygophyllaceae) 駱 駝 蓬 屬 (Peganum) 多 年 生 草 本 植物,民間常以種子或全草入藥,用于治療咳嗽氣喘、 無(wú)名腫痛、 風(fēng)濕痹痛等癥［1］。 生物堿類成分如去氫駱駝蓬堿 (Harmine)、 駱駝蓬堿 (Harmaline) 等為駱駝蓬的主要活性成分, 對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等具有廣泛的生物活性［2-3］。 前期研究發(fā)現(xiàn), 駱駝蓬堿和去氫駱 駝蓬堿等具有較強(qiáng)的抗乙酰膽堿酯酶和抗單胺氧化酶活性［4-5］。本課題 組 前 期 報(bào) 道 了 駱 駝 蓬 堿 及 去 氫 駱 駝蓬堿在體內(nèi)可以代謝生成同樣具有較強(qiáng)抗乙酰膽堿酯 酶 活 性 的 駱 駝 蓬 醇 (Harmol) 及 駱 駝 蓬 酚(Harmalol) 等 代 謝 產(chǎn) 物［6-7］, 如 圖 1 所 示。 目 前,駱駝 蓬 總 生 物 堿 (Total Alkaloid Extracts from P. harmala,TAEP) 藥代動(dòng)力學(xué)研究多限于對(duì)其主要活性成分駱駝蓬堿及去氫駱駝蓬堿單體的研究［7-8］, 并未涉 及 總 生 物 堿 多 種 成 分 共 存 情 況 下 主要活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)特征的研究。因此,本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上, 研究 TAEP中主要活性成分駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其活性代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程,為TAEP的新藥研發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與試藥

1.1 藥品與試劑 TAEP, 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所制備, 批號(hào) 110115), 經(jīng) HPLC法［9］測(cè)定 駱駝蓬堿 和 去 氫 駱 駝 蓬 堿 含 量 分 別 為 0.27 g/g與0.28 g/g； 駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿對(duì)照品 (上海中藥標(biāo)準(zhǔn) 化 研 究中 心, 純 度 98%)； 9-氨基 吖 啶(美國(guó) Sigma公司)； 乙腈為色譜純 (美國(guó) Fisher公司),其余試劑為分析純,購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司。 實(shí)驗(yàn)用水為超純水 (Millipore制備)。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)及代謝轉(zhuǎn)化途徑Fig.1 Structures of com pounds and metabolic pathways

1.2 儀 器 Waters ACQUITY UPLC-Quattro Premier XE超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (Waters, 美國(guó)),MassLynxTM4.1 工作站軟件； HGC-36A干式熱氮吹儀 (天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；5415R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (德國(guó) Eppendorf公司)；BP 211 D電子 天 平 (Sartorius, 德國(guó))； KQ-500B型超聲波清洗器 (江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水器 (美國(guó) Millipore公司)。

1.3 動(dòng) 物 清 潔 級(jí) SD 大 鼠 16 只, 體 質(zhì) 量(220 ±30)g, 雌雄各半, 合格證號(hào) SCXK2008-0016, 由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 大鼠血漿中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇和駱駝蓬酚的測(cè)定 參考前期建立的 UPLC-MS/MS 法測(cè)定比格犬血漿樣品中駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的方法［7］, 重 點(diǎn)考察了 該 方 法用 于 檢 測(cè)大 鼠 血漿樣品中駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的專屬性、線性及基質(zhì)效應(yīng)。

2.1.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1.1 色譜條件 使用 Waters-ACQUITYTM UPLC system系統(tǒng)分離 ；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 mm ×2.1 mm,1.7 μm)； 流 動(dòng) 相 為 0.1%甲酸水 (A)-乙 腈 (B)； 采 用 梯 度 洗 脫 (0 ～2.5 min,9% ～13%B； 2.5 ～2.51 min,13% ～14.5%B； 2.51 ～4.0 min,14.5% ～15.5%B；4.0 ～4.01 min,15.5% ～90%B； 4.01 ～5.0 min, 90%B； 5.0 ～6.0 min,9%B)； 體 積 流 量 0.4 mL/min；柱溫 35 ℃； 進(jìn)樣體積為 5 μL。

2.1.1.2 質(zhì)譜條 件 使用 Micromass Quattro Premier XE串聯(lián) 三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)合電噴霧 (ESI) 作為分析檢測(cè)的儀器。在正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,各待測(cè)物選用的檢測(cè)離子對(duì)分別為:駱駝蓬堿,215.20→172.05； 去氫駱駝蓬堿,213.52→169.92； 駱駝蓬醇,199.15→171.11； 駱駝蓬酚, 201.20 → 160.20； 9-氨 基 吖 啶 ( 內(nèi) 標(biāo),IS), 199.08→171.11。 質(zhì)譜參數(shù): 毛細(xì)管電壓 2.5 kV；錐孔電壓 50 V；碰撞電 壓 25 V； 萃 取 電 壓 2.0 V；離子源溫度120 ℃； 脫溶劑溫度400 ℃； 脫溶劑氣700 L/h(N2)； 錐孔氣 75 L/h。 N2(純度 99.9%)和氬氣 (純度 99.999%) 分別用作錐孔氣及碰撞氣。各待測(cè)物質(zhì)譜檢測(cè)方法的檢測(cè)時(shí)間段、錐孔電壓 和 碰 撞 電 壓 分 別 為: 駱 駝 蓬 堿,3.00 ～4.50 min,40 V,20 V； 去 氫 駱 駝 蓬 堿,3.50 ～4.50 min,55 V,30 V； 駱 駝 蓬 醇,1.35 ～2.00 min,50 V,30 V； 駱 駝 蓬 酚,0.50 ～1.60 min,40 V,20 V； IS,2.00 ～3.00 min, 50 V,30 V。 數(shù)據(jù) 采 集 與處理通 過(guò) MassLynx 4.1 軟件完成。

2.1.2 對(duì)照品溶液和質(zhì)控樣品的制備 對(duì)照品溶液:分別精密稱取駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬 醇、 駱 駝 蓬 酚 對(duì) 照 品 4.00、 4.00、 2.00、2.00 mg, 置 于 10 mL棕 色 量 瓶 中, 加 乙 腈 溶 解 并稀釋至刻度搖勻,配制成駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、 駱駝蓬醇、 駱駝蓬酚質(zhì)量濃度分別為 0.40、 0.40、 0.20、 0.20 mg/mL的混合對(duì)照品母液； 精密稱取 IS 對(duì) 照 品 2.00 mg, 置 于 10 m L棕 色 量 瓶中, 加乙腈溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 配制成 IS質(zhì)量濃度為 0.20 mg/mL的 IS 母液。

質(zhì)控樣品 (QC): 取混合對(duì)照品母液用初始流動(dòng)相 (含 0.1%甲 酸的 9%乙腈溶 液) 稀釋制得低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品,質(zhì)量濃度分別為1.0、20、 500 ng/mL( 駱 駝 蓬 堿 與 去 氫 駱 駝 蓬堿)； 0.5、 10、 250 ng/mL( 駱 駝 蓬 醇 與 駱 駝蓬酚)。

2.1.3 血漿樣品的處理方法 100 μL血漿中加入50 ng/mL的 IS 溶 液 100 μL, 渦 旋 混 合 1 min, 加入 200 μL乙 腈 (0 ℃),15 000 ×g 離 心 10 min (4 ℃), 移取上清液 320 μL,N2吹干, 殘留物加入初 始 流 動(dòng) 相 80 μL, 渦 旋 1 min 使 其 溶 解, 15 000 ×g離心 10 min(4 ℃), 取上清 液 進(jìn)樣。

2.1.4 方法的專屬性考察 采用 UPLC-MS/MS 法檢測(cè)大鼠血漿樣品中駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的血藥濃度。駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿、 駱駝蓬醇、駱駝蓬酚及 IS 保留時(shí)間分別為 3.77、 3.91、 1.55、 1.35、 2.36 min, 血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取混合對(duì)照品母液用乙腈稀釋成駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿質(zhì)量濃度為1.0、 2、 5、 10、 20、 50、 100、 200、 500 ng/mL, 駱駝蓬醇與駱駝蓬酚質(zhì)量濃度為 0.5、 1、 2.5、 5、 10、25、50、 100、250 ng/mL。取 IS 對(duì)照品母液用乙腈稀釋成 50 ng/mL的 IS 溶液。 取 100 μL空白血漿,加入各質(zhì)量濃度的對(duì)照品、 50 ng/mL的 IS 溶液和乙腈各 100 μL, 渦 旋 混 合 1 min,15 000 ×g 離 心 10 min(4 ℃), 移取上清液320 μL,N2吹干, 殘留物加入 初 始 流 動(dòng) 相 80 μL, 渦 旋 1 min 使 其 溶 解, 15 000 ×g 離心 10 min(4 ℃), 上 清 液, 即 為 系 列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,結(jié)果表明各組分線性關(guān)系良好, 結(jié)果見表1, 色譜圖見圖2。

表1 血漿中待測(cè)物及代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、 線性范圍及定量限 （n=6）Tab.1 Calibration curves， linearity range， and lim it of quantification of analytes and itsmetabolites in p lasma （n=6）

圖 2 空白血 漿 （ A） 、 混合 對(duì) 照 品 （ B， 定 量 限 ） 、 灌 胃 30 m in后 的 血 漿 樣 品 （ C） 及 靜 脈 注 射 30 m in后 的 血 漿 樣 品（D） 色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma （ A） ， m ixture reference（ B， the LOD of reference） ， plasma samp le after 30 m in of oral adm inistration（ C） and plasma sample after 30 m in of intravenous adm inistration（ D）

2.1.6 基質(zhì)效應(yīng) 取低、 中、 高 3 個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣品, 每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析。 同時(shí),另取空白血漿 100 μL, 除不加入標(biāo)準(zhǔn)溶液外, 其它按 “2.1.3” 項(xiàng)下的方法操作, 所得的殘留物加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和 IS 溶液, 渦旋混合,進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)的峰面積。結(jié)果表明,本方法低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度樣品的回收率均在85% ～115%之間, 樣品不受基質(zhì)干擾。

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 供 試 樣 品 的 制 備 稱 取 350 mg TAEP, 加入 24 m L 0.3%CMC-Na溶 液 及 1m L 0.1 mol/L HCl, 制得 14.0 mg/mL的 混 懸 液 25 mL(口 服 用,含去氫駱駝蓬堿與駱駝蓬堿分別為 3.92 和 3.78 mg/mL)； 分別稱取 16.68 mg駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿對(duì)照 品 適量, 加入24 mL生理 鹽 水及1 mL 0.1 mol/L HCl, 制得含駱駝 蓬堿與去 氫 駱 駝蓬堿分別為 0.667 mg/mL的混合靜脈注射液。

2.2.2 給藥方案 SD大鼠 16 只, 隨機(jī)分為 2 組,每組8 只, 雌雄各半, 試驗(yàn)前禁食不禁水12 h。 一組灌胃給予劑量為 140 mg/kg的 TAEP, 給藥后 2、5、 15、 30、 45 min、 1、 2、 4、 8、 12、 24 h 于 眼眶靜脈叢取血 0.25 mL； 另一組尾靜脈注射給予駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿的混合溶液,劑量為3.33 mg/kg, 給 藥 后 2、 5、10、 20、30、 45 min、1、 2、 4、8、 12、 24 h 于 眼 眶 靜 脈 叢 取 血0.25 mL。 血樣 置 于肝素化離 心 管,4℃ 5 000 ×g離心 15 min 制備血 漿, 血漿保存 在 -80℃ 待 測(cè)。

2.2.3 血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 血漿樣品經(jīng)過(guò)處理后進(jìn)行 UPLC-MS/MS 測(cè)定, 測(cè)得給藥后不同時(shí)間點(diǎn)駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚血藥濃度。

大鼠靜脈給予駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿的混合溶 液 ( 分 別 3.33 mg/kg) 后, 測(cè) 得 的 駱 駝 蓬 堿 、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的藥 -時(shí)曲線見圖 3。 由圖 3-A可見, 靜脈給藥后駱駝蓬堿及去氫駱駝蓬堿的血藥濃度迅速下降,但直至24 h時(shí)還能檢測(cè)到一定濃度的駱駝蓬堿及去氫駱駝蓬堿。但是,值得注意的是給藥后去氫駱駝蓬堿的初始血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于駱駝蓬堿的血藥濃度,前者約比后者高出 8 倍左右。 由圖 3-B可見, 在2 min時(shí)即可檢測(cè)到 去 氫 駱駝蓬堿 的 代 謝產(chǎn)物駱駝蓬醇,20min 時(shí)血藥濃度即達(dá)到峰值, 然后出現(xiàn)迅速下降, 至24 h還能檢測(cè)到較低的血藥濃度。 同樣, 在給藥后 2 min 也可檢測(cè)到駱駝蓬堿的代謝產(chǎn)物駱駝蓬酚,20min 時(shí)達(dá)到血藥濃度峰值, 但隨后血藥濃度呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢(shì)。結(jié)果與比格犬靜脈注射駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿后體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為相似［7］。

大鼠 灌 胃 給 予 TAEP 140 mg/kg后, 測(cè) 得 的 駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的藥 -時(shí)曲線見圖 3。 由圖 3-C可見, 灌胃給藥2 min 后即可在血中檢測(cè)到很高濃度的駱駝蓬堿及去氫駱駝蓬堿,其中駱駝蓬堿的血藥濃度在4 h時(shí) 達(dá)到峰值, 隨 后 較 緩 慢 下 降, 到 24 h 時(shí) 還 能檢測(cè)到濃度較低的駱駝蓬堿。去氫駱駝蓬堿血藥濃度在 2 min 時(shí) 即 達(dá)到 峰 值, 然 后 出 現(xiàn) 迅 速 下 降 至45 min時(shí) 開 始 緩 慢 上 升, 到 2 h 時(shí) 出 現(xiàn) 第 二 個(gè) 峰值, 其后又開始緩慢下降, 一直 到 24 h時(shí) 還能檢測(cè)到濃度較低的去氫駱駝蓬堿。 由圖 3-D可見, 在2 min 時(shí)即可檢測(cè)到去氫駱駝蓬堿的代謝產(chǎn) 物駱駝蓬醇,5 min 血藥濃度即 達(dá)到峰值, 然后出 現(xiàn)迅速下降至45 min 時(shí)又開始 緩 慢上升, 到 1 h 時(shí)出現(xiàn)第二個(gè)峰值, 其后開始緩 慢 下 降,4 h至24 h血 藥 濃度一直維持在一個(gè)水平,稍有上下波動(dòng)。而駱駝蓬堿的代謝產(chǎn) 物 駱 駝蓬酚在 30 min 時(shí) 被檢測(cè)到, 隨后一直 緩慢上升, 至 24 h未出現(xiàn)峰值。 結(jié) 果與比格犬口服駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿后的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為相似［9］。

圖 3 大鼠靜脈 注 射駱駝蓬 堿 與去氫駱 駝 蓬堿的混 合 溶液 （3.33 mg/kg） 和 口 服駱駝 蓬 總 生物堿 （140 mg/kg） 后原型 駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿 （A、 C） 和代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、 駱駝蓬酚 （B、 D） 平均血藥濃度-時(shí)間曲線 （n=8，）Fig.3 Mean p lasma concentration-time curves of harmaline， harm ine（ A， C） and their metabolites harmol， harmalol（ B， D） in rats after intravenous adm inistration of m ixed solution of harmaline and harm ine（3.33 mg/kg） and oral adm inistration of total alkaloid extracts（140 mg/kg） from Peganum harmala L.（ n=8，）

將血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用非房室模型藥動(dòng)學(xué)軟 件 PK solution 2TM(Summit Research Services, USA) 處理得到各主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 包括峰濃度 (Cmax)、 達(dá) 峰 時(shí)間 (Tmax)、 血藥濃度-時(shí)間 曲 線下 面 積 (AUC0-t與 AUC0-∞)、 消 除 速 率 常 數(shù)(Ke) 、 消 除半衰 期 (t1/2e) 、 吸 收 速 率 常 數(shù) (Ka) 、吸收半衰 期 (t1/2a)、 分 布 速率常數(shù) (Kd)、 分 布 半衰期 (t1/2d)、 平均滯留時(shí)間 (MRT)、 表觀分布容積 (Vd)、 血漿清除率 (CL) 及生物利用度 (F)。參照參考文獻(xiàn)［10］, 代謝 產(chǎn) 物 駱 駝 蓬 醇的給藥劑量按原型去氫駱駝蓬堿劑量計(jì)算,靜脈注射給藥后駱駝蓬醇的體內(nèi)過(guò)程按口服方式處理。通過(guò)劑量校正, 分別計(jì)算口服 TAEP后駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿的絕對(duì)生物利用度。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 () 表示, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用 t檢驗(yàn)和SPSS 方差分析,P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果見表 2。 由于駱駝蓬酚血藥濃 度 在 24 h 時(shí)還處于緩慢上升過(guò)程,因此其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)未能計(jì)算獲得。

從表 2 可以看出, 口服 TAEP后駱駝蓬堿、 去氫駱駝蓬堿 和 駱駝蓬醇的 Cmax分別為 347.6、 184.5和 32.7 ng/mL,Tmax分 別 為 3.200、 1.150、0.300 h,t1/2e分 別 為 6.994、 5.625、 21.912 h, MRT分別為 8.588、 9.791 、 27.780 h,AUC0-t為2 755.5、 1 202.8 、 129.8(ng.h)/mL。 靜 注 給藥后, 駱駝蓬堿、 去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬醇的 t1/2e分 別 為 2.554、3.116、 1.899 h,MRT 分 別 為1.700、 1.311 、 1.880 h,AUC0-t為 373.1、2 033.0 、 8.914(ng.h)/mL。 口服總生物堿后駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的絕對(duì)生物利用度分別為63.22%和 4.96%。

表 2 大 鼠口服駱 駝 蓬總生物 堿 （140 mg/kg） 與靜脈注 射駱 駝 蓬 堿 及去 氫 駱 駝 蓬堿 的 混 合 溶 液 （3.33 mg/kg） 后 駱 駝 蓬堿、 去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) （n=8，）Tab.2 Pharmacokinetics parameters of harmaline， harm ine and their metabolites in rats after oral adm inistration of total alkaloid extracts（140 mg/kg） from Peganum harmala L.and intravenous adm inistration of m ixed solution of harmaline and harm ine（3.33 m g/kg） （n=8，）

表 2 大 鼠口服駱 駝 蓬總生物 堿 （140 mg/kg） 與靜脈注 射駱 駝 蓬 堿 及去 氫 駱 駝 蓬堿 的 混 合 溶 液 （3.33 mg/kg） 后 駱 駝 蓬堿、 去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) （n=8，）Tab.2 Pharmacokinetics parameters of harmaline， harm ine and their metabolites in rats after oral adm inistration of total alkaloid extracts（140 mg/kg） from Peganum harmala L.and intravenous adm inistration of m ixed solution of harmaline and harm ine（3.33 m g/kg） （n=8，）

注: 與駱駝蓬堿比較,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001； 與去氫駱駝蓬堿比較,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001

口服靜脈參數(shù) 駱駝蓬堿 去氫駱駝蓬堿 駱駝蓬醇 駱駝蓬堿 去氫駱駝蓬堿 駱駝蓬醇Cmax(ng/m L) 347.6 ±221.8 184.5 ±73.7 32.7 ±24.4** 458.1 ±125.5 3 671.0 ±668.1***6.804 ±1.990*###Tmax(h) 3.200 ±1.095 1.150 ±0.822** 0.300 ±0.398*** 0.033 ±0.000 0.033 ±0.000 0.344 ±0.250***###Ke(h-1) 0.170 ±0.144 0.162 ±0.070 0.034 ±0.010*# 0.317 ±0.141 0.272 ±0.130 0.460 ±0.236#Kd(h-1) 0.284 ±0.120 0.761 ±0.467 0.454 ±0.447 - - -Ka(h-1) 0.446 ±0.092 0.763 ±0.561 0.808 ±0.590 - - -t1/2e(h) 6.994 ±5.188 5.625 ±4.145 21.912 ±7.377**## 2.554 ±1.061 3.116 ±1.520 1.899 ±0.989 t1/2d(h) 2.805 ±1.121 1.473 ±1.283 7.389 ±8.677 - - -t1/2a(h) 1.609 ±0.333 1.375 ±0.934 1.367 ±0.945 - - -AUC(0-t)(ng.h/m L)2 755.5 ±1 934.8 1 202.8 ±619.6 129.8 ±102.6** 373.1 ±105.1 2 033.0 ±370.1***8.914 ±1.338**###AUC(0-∞)(ng.h/mL) 2920 ±1994 1 352.1 ±611.8 244.8 ±200.5** 384.5 ±100.4 2 101.1 ±378.0***10.124 ±1.814**###MRT(h) 8.588 ±4.198 9.791 ±4.517 27.780 ±11.374**## 1.700 ±0.982 1.311 ±0.571 1.880 ±0.760 Vd(m L/kg) 246 894 ±296 932 273 197 ±179 688 9 714 025 ±7 838 742**##32 597 ±11 719 7 233 ±3 823 903 986 ±504 774***###CL(m L/h/kg) 20 292 ±13 440 36 745 ±20 424 375 156 ±356 990*# 9 202 ±2 297 1 608 ±243 335 719 ±61 566***###F 63.22% 4.96% ----

3 討論

駱駝蓬 總 生 物 堿 是 駱 駝 蓬 主 要 活 性 部 位［11］,其中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量之和超過(guò)50%,甚至高達(dá) 85.49%, 二者的含有量之比 大約 1 ∶1［9］。 前期報(bào)道發(fā)現(xiàn)駱駝蓬堿在大鼠體內(nèi)不 僅可以通過(guò)脫烷基化代謝生成駱駝蓬酚,還能夠迅速脫氫代謝生成去氫駱駝蓬堿,隨后代謝產(chǎn)生駱駝蓬醇［6］。 研究發(fā)現(xiàn) 駱 駝 蓬 堿、 去 氫 駱 駝 蓬 堿 及 其 代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚均具有很強(qiáng)的抗膽堿酯酶活性, 表明 TAEP具有開發(fā)成治療老年癡呆癥藥物的潛能。 因此, 對(duì) TAEP中駱駝蓬堿、 去氫駱駝蓬堿及其代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇、駱駝蓬酚的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行研究是非常有必要的。

靜脈注射相同劑量駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿后,去氫駱駝蓬堿的初始血藥濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于駱駝蓬堿,一方面可能是去氫駱駝蓬堿的代謝速率比駱駝蓬堿慢所致,另一方面駱駝蓬堿在體內(nèi)可以代謝轉(zhuǎn)化成去氫駱駝蓬堿進(jìn)一步增加了二者血藥濃度的差異。具體原因有待于進(jìn)一步通過(guò)駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的代謝速率等方面進(jìn)行研究和證明。

灌胃給藥后,對(duì)駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的藥動(dòng) 學(xué) 參 數(shù) 進(jìn) 行 比 較, 兩 者 的 Tmax、 Cmax、 AUC、Vd、 CL等均存在一定的差異, 但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(除 Tmax外)。 代 謝 產(chǎn)物駱駝 蓬 醇 和駱駝蓬 酚 的 Cmax及 AUC0-t較原型去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿小, 說(shuō)明除了這兩個(gè)主要代謝產(chǎn)物外,其它代謝產(chǎn)物可能還占相當(dāng)?shù)谋壤?］。 兩個(gè) 原 形 藥物 駱 駝 蓬堿 與 去氫駱駝蓬堿在體內(nèi)的代謝和消除速率均較快,給藥后即刻在體內(nèi)就可檢測(cè)到代謝產(chǎn)物。而代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇的消除速率相對(duì)較慢 (代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇的MRT是原形去氫駱駝蓬堿的3倍), 尤其是駱駝蓬酚血藥濃度在 24 h內(nèi) 一 直呈上升趨 勢(shì)。一則說(shuō)明了體內(nèi)代謝產(chǎn)物的形成過(guò)程較長(zhǎng),二則說(shuō)明駱駝蓬醇和駱駝蓬酚的消除較慢。要進(jìn)一步闡明原因,有必要對(duì)駱駝蓬醇和駱駝蓬酚單體給藥后的體內(nèi)過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步研究。

駱駝蓬堿的口服生物利用度較大為 63.22%,而去氫駱駝蓬堿的口服生物利用度較小為 4.96%。而大鼠口服去氫駱駝蓬堿單體的生物利用度為19.65%［8］, 說(shuō)明總生物堿中多種共存成分對(duì)去氫駱駝蓬堿的生物利用度影響較大,原因有待于進(jìn)一步研究。另外,駱駝蓬堿與去氫駱駝蓬堿結(jié)構(gòu)類似,生物利用度卻存在較大差異,其原因和影響因素也需要進(jìn)行深入研究,以期為進(jìn)一步的新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

雖然原型藥物駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿在體內(nèi)起主要作用,但同樣具有活性的代謝產(chǎn)物駱駝蓬醇和駱駝蓬酚在體內(nèi)消除速率明顯減慢,平均滯留停留時(shí)間明顯增加,有利于整體藥效作用維持更長(zhǎng)時(shí)間。 另外, 由口服 TAEP后的藥時(shí)曲線圖 (圖3 B, D) 可以發(fā)現(xiàn),去氫駱駝蓬堿與駱駝蓬醇可能存在雙峰或多峰現(xiàn)象。一般認(rèn)為雙峰或多峰現(xiàn)象的產(chǎn)生與肝腸循環(huán)有關(guān),還有學(xué)者認(rèn)為腸道不同部位的吸收時(shí)間和速率的不一致也是造成雙峰和多峰的原因［12-13］。 此 外, 駱 駝 蓬 堿 及 去 氫 駱 駝 蓬 堿 的 相 互代謝轉(zhuǎn)化也很有可能是產(chǎn)生多峰的原因之一。要進(jìn)一步確定是否確實(shí)存在雙峰或多峰現(xiàn)象及闡明產(chǎn)生的原因,有必要對(duì)更多數(shù)量和不同種屬的動(dòng)物的去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬醇單體給藥后的體內(nèi)過(guò)程進(jìn)行比較研究。

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Pharm acokinetics of harm aline,harm ine and their m etabolites in rats adm inistered w ith total alkaloid extracts from Peganum harmala L.

SHI Xiao-yuan1, LIU Wei1, ZHANG Lei1, LI Shu-ping1, CHENG Xue-mei1,2, XI Yang3, WANG Chang-hong1,2*

(1.Institute of ChineseMateria Medica,ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine； TheMOE Key Laboratory for Standardization of ChineseMedicines and The SATCM Key Laboratory for New Resourcesand Quality Evaluation of ChineseMedicines,Shanghai201203,China； 2.Shanghai R&D Centre for Standardization of ChineseMedicines,Shanghai201203,China； 3.School ofMedicine,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang 315211,China)

AIM To study the pharmacokinetics of harmaline(HAL),harmine(HAR)and theirmetabolites in rats administered with total alkaloid extracts from Peganum harmala Linn(TAEP).METHODS Blood samples of rats orally administered with TAEP(140 mg/kg),or intravenously given mixedsolution of HAL and HAR (3.33 mg/kg),were collected at different times.The plasma concentrations of HAL,HAR and theirmetabolites harmol(HOL),harmalol(HAM)were determined by UPLCMS/MSmethod,and thus their pharmacokinetic pa-rameters were obtained.RESULTS Plasma levels of HAL,HAR,HOL and HAM could be detected in rats dosed with intravenousmixture of HAL and HAR or oral intaking of TAEP.The pharmacokinetics of HAL,HAR and HOL were determined except HAM,due to a failure in its plasma concentration drop at24 h.For the intravenous group,all the disposition parameterswere:t1/2eof of HAL,HAR and HOLwere2.554,3.116 and 1.899 h；MRT 1.700,1.311 and 1.880 h； and AUC0-tof 373.1,2033.0 and 8.914 ng.h/mL,respectively.For the group with oral administration of TAEP,the acquired parameterswere:Cmaxof HAL,HAR and HOL 347.6,184.5 and 32.7 ng/mL； Tmax3.200,1.150 and 0.300 h； t1/2e:6.994,5.625 and 21.912 h； MRT 8.588,9.791 and 27.780 h； AUC0-t2755.5,1202.8 and 129.8 ng.h/mL,respectively.The absolute bioavailability of HAL and HAR were 63.22%and 4.96%after oral administration,respectively.CONCLUSION HAL and HAR from oral intakes of TAEP could be quickly absorbed and rapidlymetabolized,and HAL displayed a higher bioavailability value than HAR.The metabolites(HOL and HAM)are eliminated more slowly than the prototypes(HAL and HAR).In addition,the initial plasma concentration of HAR is significantly higher than HAL in intravenous use.

Peganum harmala L.； alkaloid extracts； harmine； harmaline； metabolites； pharmacokinetics

R969.1

:A

:1001-1528(2014)06-1169-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.013

2014-02-11

國(guó)家自然基金-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (U1130303), 國(guó)家自然基金項(xiàng)目 (81173119), 國(guó)家 “重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項(xiàng) (2012ZX0910320-051), 上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人計(jì)劃資助項(xiàng)目 (13XD1403500), 寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (2013A610207)

史小媛 (1988—), 女, 碩士生, 研究方向: 藥物制劑與體內(nèi)過(guò)程。 Tel:(021)51322511,E-mail:Sxy1988916@163.com

*通 信作 者: 王 長(zhǎng)虹 (1964 —), 男, 研究 員, 博 士 生 導(dǎo) 師, 研 究 方 向: 中 藥 新 制 劑 與 體 內(nèi) 過(guò) 程 研 究。 Tel:(021)51322511,E-mail: wchcxm@hotmail.com