牟景麗， 何 峰，2， 黃 勇，2， 劉麗君， 鄭 林，2*

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004）

齊墩果酸生物黏附膠囊的制備及其釋藥特征

牟景麗1， 何 峰1，2， 黃 勇1，2， 劉麗君1， 鄭 林1，2*

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院， 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004）

目的 制備齊墩果酸生物黏附膠囊并研究其釋藥特征。方法 采用單因素正交設(shè)計(jì)法,確定羥丙甲基纖維素K4M、 卡波姆 971PNF、 乳糖的用量及配比與制劑體外釋放度及黏附力的關(guān)系。 以齊墩果酸生物黏附膠囊在大鼠胃黏膜滯留率考察其生物利用度,并對其釋藥過程進(jìn)行動力學(xué)方程擬合以判斷釋藥機(jī)制。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)表明羥丙甲基纖維素與卡波姆均能阻滯藥物的釋放和對胃腸組織有較大的黏附力。 生物黏附膠囊釋藥以 Higuchi方程擬合最佳, 與 Peppas方程也有較好的相關(guān)性。結(jié)論 該處方設(shè)計(jì)及制備工藝合理。其釋藥特征說明擴(kuò)散和溶蝕均起作用,但擴(kuò)散機(jī)制所占的比例相對較大。

齊墩果酸； 卡波姆 971PNF； 羥丙甲基纖維素 K4M； 生物黏附膠囊； 釋放度

齊墩果酸 (oleanolic acid,OA) 為五環(huán)三萜類化合物,廣泛存在于食物和植物中。齊墩果酸可以降轉(zhuǎn)氨酶,對急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用,促進(jìn)肝細(xì)胞再生,防止肝臟病變；臨床所用的齊墩果酸制劑為治療黃疸型肝炎、慢性遷移性肝炎及慢性活動性肝炎的齊墩果酸片劑和膠囊劑［1-2］。

胃腸道生物黏附制劑［3-5］是近年來研究較 多的新型給藥系統(tǒng),它不僅能延長藥物制劑在胃腸道的滯留時間,還能增加藥物與吸收黏膜的接觸,改變細(xì)胞膜的流動性,增加藥物對小腸上皮細(xì)胞的穿透力。因而可以促進(jìn)藥物吸收,提高生物利用度［6-7］。 齊墩果酸 為 難 溶 性 藥 物, 水 溶 性 較 低, 在胃腸道內(nèi)停留時間短,也不利于藥物充分吸收。為了延長齊墩果酸在胃腸道內(nèi)的停留時間,增加在體內(nèi)的吸收,從而達(dá)到緩、控釋給藥,減少給藥次數(shù)的目的。因此,本研究利用生物黏附技術(shù),將其制成生物黏附膠囊,以期增加其胃腸道內(nèi)的停留時間, 提高其生物利用度［8］。

1 儀器與材料

齊墩果酸對照品 (中國食品藥品檢定研究院,純度≥98%, 批號 110709-200505)； 齊墩果酸原料藥 (長 沙 九 芝 堂 制 藥 廠, 純 度 ≥95.1%, 批 號20040306)； 羥丙甲基纖維素 (HPMC, 規(guī)格 K4M、K15M、 K100M) 和 卡 波 姆 ( 型 號 CP974PNF和CP971PNF)( 上海 Colorcon 公司)； 藥用乳糖、聚乙烯比咯烷酮 (PVP)K30(上海運(yùn)宏化工輔料制劑技術(shù)有限公司)。

Prominence LC-20A型 高 效 液 相 色 譜 儀、 UV-2401PC型紫外分光光度計(jì) (日本島津公司)；ZB-2 型崩解儀、 RC806 型智能溶出儀 (天津市天大天發(fā)科技有限公司)； 黏附力測定裝置 (自制)。

SD大鼠 ［250 g, 雌雄不限, 貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心, 批號 SCXK(黔)2002-0001］。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定方法

2.1.1 最大波長的選擇 精密稱取齊墩果酸對照品10 mg, 并配 制 為 1 mg/mL的 甲 醇 溶 液 ；精 密 吸取 0.3 mL于 10 mL量 瓶 中, 用 0.5%十 二 烷 基 硫酸鈉 (以下簡稱 SDS) 溶液定容, 即得對照品溶液。 以 0.5%SDS 溶 液 為 空 白 對 照, 在 190 ～500 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。 結(jié)果表明齊墩果酸在 205 nm處有最大吸收。

2.1.2 色 譜 條 件 Onyx Monolithic C18色 譜 柱(4.6 mm×100 mm)； 流 動 相 乙 腈 -0.5%乙 酸 溶液 (80 ∶20)； 體 積 流 量 1 mL/min； 檢 測 波 長205 nm, 柱溫 35 ℃, 進(jìn)樣量 10 μL。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.01、 0.05、 0.15、 0.25、 0.25、 0.45 m L 于10 mL量瓶中, 按 “2.1.1” 項(xiàng)下操作, 配制成質(zhì)量濃度為 1、5、 15、25、35、45 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)供試液,10 μL進(jìn)樣。 以溶液質(zhì)量濃度 (μg/mL) 為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸方程:A= 30 544 978.5C-2 948.4(r=0.999 3), 線 性 范 圍為 1 ～45 μg/mL。

2.1.4 精密度考察 取 “標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備” 項(xiàng)下低、中、高3個質(zhì)量濃度的溶液,于高效液相色譜儀測定其吸收度 A,24 h 內(nèi)重復(fù)測定 5 次, 計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d計(jì)算日間精密度,結(jié)果表明: 該方法的日內(nèi)、 日間精密度 RSD＜3%(n= 5), 表明日內(nèi)、 日間精密度良好, 符合要求。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 按標(biāo)示量的 80%、100%、120%精密稱取齊墩果酸及其輔料的混合物, 按“2.1.1” 項(xiàng)下操作, 配制成適當(dāng)濃度的 0.5%SDS溶液, 取續(xù)濾液 10 μL進(jìn)樣, 以測得量與加入量相比較, 計(jì)算回收率及 RSD, 平均回收率在 98.6% ～100.6%之間,RSD＜3%(n=9), 符合要求。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取生物黏附細(xì)粉, 按“2.1.1” 項(xiàng) 下 操 作, 配 制 成 30 mg/m L的 0.5% SDS 溶液, 置 37 ℃水浴中, 分別在 0、 1、2、 4、6、 8、10、 12 h 取 樣,10 L進(jìn) 樣 。 所 測 峰 面 積 的RSD為 1.12%(n=8), 表 明 齊 墩 果 酸 的 0.5% SDS 溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 齊墩果酸生物黏附膠囊的制備

2.2.1 制備工藝 按處方量稱取齊墩果酸原料藥及各種輔料, 過 80 目篩并充分混勻, 用含 8% PVP K30 的 95%乙 醇 溶 液 制 軟 材,20 目 篩 制 粒, 50 ℃下烘干2 h,20 目篩整粒, 裝入1 號膠囊, 即得生物黏附膠囊, 每片含齊墩果酸30 mg。

2.2.2 處方篩選與優(yōu)化 采用單因素法, 保持主藥齊墩果酸用量為30 mg不變, 考察輔料包括黏附材料、骨架材料、填充劑 (乳糖) 的種類及用量對齊墩果酸生物黏附緩釋膠囊釋放度和黏附力的影響,從而確定膠囊的最優(yōu)處方。且釋放度均用相似因子法進(jìn)行評價［9］。

2.3 體外釋放度的測定 采用中國藥典 2010 版第二部附錄X C第一法裝置 (籃 法), 以 脫 氣 0.5%十二烷 基 硫酸鈉 (SDS) 溶 液 900 m L為 溶 出 介 質(zhì),轉(zhuǎn) 速 為 100 r/min, 溫度 37.5 ℃, 分 別 于 1、 2、 4、6、 8、10、 12 h 取 樣 5 mL, 同 時 補(bǔ) 充 同 溫 等 量 介質(zhì) 5 mL, 用0.45 μm微孔濾膜過濾, 棄去初濾液,續(xù)濾液10 μL進(jìn)行高效液相色譜法測定。

2.4 生物黏附 膠 囊 體 外 黏 附 力 評 價［10-13］大 鼠 黏膜組織制備: 實(shí)驗(yàn)前動物禁食不禁水12 h, 取出胃和小腸,縱向剖開,用磷酸鹽緩沖液沖去內(nèi)容物,將其固定于縱向切開的聚乙烯管上。

實(shí)驗(yàn)裝置圖見文獻(xiàn)［12］ 報道。 分別選取 20 目粒徑范圍的黏附顆粒 100 粒, 均勻鋪撒在小腸或胃黏膜上。 將聚乙烯管傾斜 60℃, 置盛有飽和硝酸鉀溶液的干 燥 器 (RH=92.5%) 內(nèi), 放置 20 min,使顆粒充分水化并與小腸胃黏膜發(fā)生相互作用。然后將聚乙烯管傾斜度 45℃, 用蠕動泵控制磷酸鹽緩沖液流速由上至下進(jìn)行淋洗,淋洗流速為40 mL/min, 記錄滯留于 大鼠小腸或胃黏膜 上的顆粒數(shù),計(jì)算顆粒在腸或胃黏膜上的滯留率。

滯留率%=淋洗后顆粒數(shù)/100 ×100%

2.5 單因素考察 以輔料的型號、 用量設(shè)計(jì)各處方,并按下表各處方順序進(jìn)行單因素考察,篩選出各輔料的型號和最佳用量, 各處方組成見表1。

表1 單因素考察Tab.1 Single factor exp loration

以各處方 2、 6、 12 h 的累積釋放 度 Q值及黏附力為評價指標(biāo),結(jié)果各輔料型號、用量分別為HPMC K4M 48 mg、 CP971PNF 9 mg、 乳 糖 用 量10 mg時較好。 結(jié)果如表 2 ～3 所示。

表2 單因素考察結(jié)果Tab.2 Results of single factor exp loration

表3 單因素相似因子考察結(jié)果Tab.3 Sim ilarity factor of single factor exploration

2.6 正交設(shè)計(jì)

2.6.1 因素水平的確定 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以 HPMC用量、 乳糖用 量、 乳 糖 用 量 為 3 因 素,各安排3水平進(jìn)行正交, 見表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels of orthogonal test

2.6.2 正 交 設(shè) 計(jì) 處 理 方 法［9］為 兼 顧 各 項(xiàng) 指 標(biāo),采用綜合加權(quán)評分法,將兩指標(biāo)轉(zhuǎn)化為單一指標(biāo)。兩個單項(xiàng)指標(biāo)的獲得方法如下:

①釋放度指標(biāo) f1按 A=(R2+R6+R12)/3計(jì)算,式中A為溶出度評價參數(shù),凡為2 h的累百分率評價分?jǐn)?shù),2 h 累積溶出 20%計(jì)為 100 分, 每增加或減少 1%則減 2 分,6 h 累積溶 出 60%計(jì)為100 分, 每增加 或 減少 1%則減 2 分,R12為 12 h 的累積溶出百 分率的 評價分?jǐn)?shù),12 h 累積溶 出 90%計(jì)為100 分每增加 1%加2 分, 每減少 1%減 2 分。Amax為測得的最大值, 歸一化后釋放度指標(biāo)為

各處方釋放度指標(biāo)、黏附力指標(biāo)和綜合指標(biāo)計(jì)算結(jié)果見表 5, 方差分析見表 6。

表5 正交設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal test

表6 方差分析結(jié)果Tab.6 Result of ANOVA

一致性子集表結(jié)果見表7。

表7 綜合指標(biāo)一致性子集Tab.7 Consistent subset table of capsu les

通過方差分析及一致性子集表分析,A、 B、C三因素中A、B因素具有顯著性差異,在所選因素范圍內(nèi),CP971PNF、 HPMCK4M、 乳糖不同用量,各因素作用主次順序?yàn)?B＞A＞C, 其最佳工藝條件為 A3B2C2。

2.7 釋藥機(jī)制的探討 按照最優(yōu)處方制備 3 批齊墩果酸黏附膠囊,進(jìn)行釋放度試驗(yàn)。將3批生物黏附膠囊 R t的平 均 值 -t曲線 (R t-t曲線) 分別 以 零級、 一級、 Higuchi、 Peppas方 程 進(jìn) 行 擬 合, 并 按Peppas方程計(jì)算釋放參數(shù)以判斷釋藥機(jī)制。 3 批齊墩果酸生物黏附膠囊的釋放度和黏附力結(jié)果如圖1、 圖 2 所示。 R t-t曲線 (見圖 1) 的零級、 一級、Higuchi以及 Peppas方程見表 8。

圖 1 3 批齊墩 果 酸 生物黏附 膠 囊的 R t-t曲線Fig.1 Curve of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches dissolution

圖2 3批齊墩果酸生物黏附膠囊的黏附力Fig.2 Adhesive force of oleanolic acid bioadhesive-coated capsules in three batches

表8 擬合的釋藥方程Tab.8 Analysis of release data from bioadhesive-coated capsules using different equations

結(jié)果表明, 黏附膠囊釋放曲線用 Higuchi釋放方程擬合相關(guān)性較高,表明黏附膠囊的釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主。 經(jīng) Peppas方程擬合也有較好的相關(guān)性。根 據(jù) Peppas方 程:Mt/M∞=knt, 即 In Mt/M∞= n lnt+Ink, 式 中 Mt/M∞為 藥物在某一 時 刻的累積釋放百分?jǐn)?shù),t為時間,k為釋放常數(shù),n為釋放參數(shù), 該參數(shù)是 PePpas方程中表征釋放機(jī)制的特征參數(shù), 計(jì)算結(jié)果表明 n=0.83( ＜0.89), 表明釋放時,擴(kuò)散和溶蝕均起作用,擴(kuò)散機(jī)制所占的比例相對較大。

4 討論

4.1 隨著 CP971 用量的增加, 釋放度相應(yīng)減少,這是因?yàn)楫?dāng)處方中含有較多的 CP971 時, 藥物釋放過程中形成了微凝膠團(tuán),藥物被包裹在微凝膠團(tuán)中,需通過微凝膠團(tuán)擴(kuò)散和凝膠團(tuán)的溶蝕而釋放,使得藥物在檢測的時間內(nèi)完全釋放比較困難,因此釋放速 度 可 能 很 緩 慢［13］。 HPMC水 化 形 凝 膠 層,控制藥物的釋放速度。因此在方差分析中, HPMC、 CP對藥物的釋放有顯著性影響。 目標(biāo)制劑中釋放度和黏附性均為重點(diǎn),因此正交設(shè)計(jì)中以釋放度和黏附力結(jié)合獲得綜合指標(biāo), 以 SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析,得到優(yōu)化處方的參數(shù),并通過驗(yàn)證獲得符合要求的制劑。

4.2 生物黏附性能的體外評價方法有測定最小剝離力、 組織留存率 Rargas法等。黏附力測試預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾采用文獻(xiàn) 報 道 的 黏 附 力 測 試 裝 置［11］, 發(fā) 現(xiàn)腸黏膜容易從薄片上脫落。本實(shí)驗(yàn)對黏附力測定裝置進(jìn)行改良,通過自制的沖洗槽,將膠囊顆粒均勻鋪在胃黏膜上,用很低流速沖洗黏附顆粒,計(jì)數(shù)沖洗顆粒,所用測量方法重現(xiàn)性良好,能用于胃腸道生物黏附制劑的處方篩選。制備的齊墩果酸生物黏附膠囊對胃腸組織有較大的黏附力［12］。

4.3 通過對不同釋藥方程的擬合, 顯示優(yōu)化后的處方釋藥機(jī)制符合 Higuchi釋放, 表明生物黏附膠囊的釋放機(jī)制以溶蝕擴(kuò)散為主。 同時經(jīng) Peppas方程擬合也有較好的相關(guān)性,顯示此制劑中藥物的釋放機(jī)制為擴(kuò)散和骨架溶蝕的協(xié)同作用,這可能是因?yàn)樵卺尫懦跗?藥物釋放速度主要依賴于顆粒接觸介質(zhì)的表面積以及顆粒周圍介質(zhì)的濃度梯度而導(dǎo)致藥物的快速釋放［14］, 從而以擴(kuò)散為主的釋放機(jī)制,隨著藥物釋放的進(jìn)行,HPMC逐漸形成凝膠層, 逐開始溶蝕,藥物隨著骨架結(jié)構(gòu)的溶蝕開始緩緩釋出,此時藥物的釋放機(jī)制既有架溶蝕,又有擴(kuò)散。

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Preparation of oleanolic acid bio-adhesive-coated capsule and their release characteristics

MU Jing-li1, HE Feng1,2, HUANG Yong1,2, LIU Li-Jun1, ZHENG Lin1,2*

(1.School of Pharmacy,Guiyang Medical College,Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM, Ministry of Education,Guiyang 550004,China； 2.Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics in Guizhou Province,Guiyang 550004,China)

oleanolic acid； carbopol 971PNF； hypromellose； bioadhesive releasing rate

R944

:A

:1001-1528(2014)06-1186-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.06.016

2013-07-14

貴州省社會發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃課題 (黔科合 SY ［2013］ 3057 號)； 貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目 ( 筑科合同 ［2013204］ 4-3 號)； 貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè) (黔科合中藥字 ［2011］ 5081 號)。

牟景麗 (1987—), 女, 碩士生, 從事藥物新劑型及藥代動力學(xué)研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail:chanli@126.com

*通信作者: 鄭 林 (1981—), 女, 碩士, 副教授, 從事天然藥物活性物質(zhì)基礎(chǔ)及藥代動力學(xué)研究。 Tel:(0851)6908468,E-mail: mailofzl@126.com