王海濤，王昌祿*，李貞景，陳勉華

（天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

蓖麻餅粕是蓖麻籽榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)和多種氨基酸及礦質(zhì)元素[1-2]。蓖麻餅肥具有植物生長所需的氮、磷、鉀3大元素，尤以氮肥效力最高[3]。蓖麻餅肥含碳水化合物多，纖維素在蓖麻餅粕中含量達(dá)到了30%以上[4]，發(fā)酵時能產(chǎn)熱，會發(fā)熱燒根、燒種[5-6]。在傳統(tǒng)的有機(jī)肥堆制中，主要是利用原有的土著微生物進(jìn)行自然發(fā)酵，生產(chǎn)周期長，營養(yǎng)元素?fù)p失嚴(yán)重，效果不理想[7]。針對這一問題，申建美等[8-12]分別利用不同方法選育了能加快有機(jī)物料降解的微生物，并進(jìn)行了相關(guān)研究。在作物生長所需養(yǎng)分中，氮素可利用量的多少是限制作物生長的一個主要因素[13-14]，而有機(jī)肥與化學(xué)肥料相比的一個缺點(diǎn)就是肥效緩慢，不能滿足前期作物對營養(yǎng)元素的需求[15]。蓖麻餅粕中的蛋白質(zhì)含量豐富，具有提供高氮肥質(zhì)量的潛力，直接施于農(nóng)田，農(nóng)作物無法吸收利用，經(jīng)過微生物的分解作用，可將大分子蛋白質(zhì)分解為多肽和游離氨基酸，易于被作物吸收利用。為高效利用蓖麻餅粕，采用生物技術(shù)手段，篩選出能夠高效降解纖維素和蛋白質(zhì)的微生物，添加到餅粕中進(jìn)行發(fā)酵，達(dá)到縮短周期，減少營養(yǎng)素的損失，提高肥料利用率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓖麻餅粕：山東某蓖麻榨油生產(chǎn)基地提供；麩皮：市售。

菌種：天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)纖維素酶菌株T1-2和產(chǎn)蛋白酶菌株P(guān)3-2。

種子液培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（carboxy methylated cellulose-Na，CMC-Na）10g，蛋白胨3g，KH2PO44g，牛肉膏5g，MgSO4·7H2O 0.5g，水1 000mL。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎過40目篩的蓖麻餅粕8g，麩皮2g，MgSO4·7H2O 0.04g，CaCl20.02g，KH2PO40.04g，加6mL水?dāng)嚢杈鶆颉?/p>

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121℃、20 min。

水合茚三酮（分析純）：天津市百世化工有限公司；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-B11型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；CL-32L型全自動智能高壓蒸汽滅菌器：日本ALP公司；TDA8002型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶測定試驗(yàn)

將菌種點(diǎn)接于產(chǎn)淀粉酶鑒定培養(yǎng)基上，30℃倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出較大菌落后在其周圍的培養(yǎng)基滴加少許碘液，以剛好均勻覆蓋培養(yǎng)基表面為宜，觀察菌落周圍培養(yǎng)基有無顏色變化。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將活化后的產(chǎn)纖維素酶菌T1-2和產(chǎn)蛋白酶菌P3-2接入液體種子培養(yǎng)基中30℃、180r/min搖床培養(yǎng)18h，加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，靜置培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，餅粕在60℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，備用。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

分別設(shè)置不同發(fā)酵培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵時間、菌種接種比例、接種量、發(fā)酵溫度、pH值、麩皮含量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束時測定還原糖和游離氨基酸含量，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以游離氨基酸含量為評價指標(biāo)，以確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.4 還原糖含量測定

取發(fā)酵后的餅粕樣品少許，60℃烘干，研磨成粉末狀，稱取2.000g，加20mL自來水，30℃、180r/min搖床振蕩1h，取5mL在4 000r/min條件下離心10min，上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

取4支25mL具塞比色管，1號管作為空白對照，各加入1mL蒸餾水，2、3、4號管中加入1mL待測液，1號管以1mL蒸餾水代替，每管均加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑，將各管充分搖勻后在沸水浴中加熱10min，取出冷卻后用水用水定容至25mL。以1號管液為空白，在波長540nm處測定其吸光度值。根據(jù)3個吸光度值的平均值，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖含量，其計算公式：

1.3.5 游離氨基酸含量測定

取發(fā)酵后的餅粕樣品少許，60℃烘干，碾磨成粉末狀，稱取0.400g，精確至0.001g。加50mL蒸餾水沸水浴10min，50℃下水浴保溫30min，過濾，將濾液定容至100mL?；靹蚝笪?mL濾液到20mL比色管中，加1mL蒸餾水，水合茚三酮3mL，0.1%抗壞血酸0.1mL，加塞，密封于沸水中加熱15min，用冷水迅速冷卻并不時搖動使加熱時形成的紅色被空氣逐漸氧化褪去，待呈現(xiàn)蘭紫色時，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容至20mL，搖勻，在波長570nm處測定其吸光度值。求3次重復(fù)的平均值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得知各樣品的氨基酸含量，氨基酸含量計算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn)

按照1.3.1的方法，研究菌株T1-2和菌株P(guān)3-2有無淀粉酶活力。2株菌經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板培養(yǎng)基上長出較大菌落后，滴加碘液，菌落周圍沒有出現(xiàn)透明圈，平板培養(yǎng)基上都是藍(lán)色，說明2株菌都不產(chǎn)胞外淀粉酶。試驗(yàn)結(jié)果表明，用這2株菌混合發(fā)酵蓖麻餅粕后，餅粕中的還原糖含量的變化主要是由菌株T1-2產(chǎn)的纖維素酶降解纖維素及2株菌生長利用所致。

2.2 水分含量對發(fā)酵效果的影響

水分含量對發(fā)酵效果的影響見圖1。

圖1 水分含量對發(fā)酵效果的影響Fig.1 Effect of moisture on fermentation

由圖1可知，在菌株T1-2和菌株P(guān)3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕中，水分含量的變化對發(fā)酵效果具有一定影響。隨著水分含量的增加，游離氨基酸含量和還原糖含量都升高，在水分含量為40%時達(dá)到最高，之后隨著水分含量的增加，游離氨基酸含量和還原糖含量逐漸降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，水分含量為40%時最有利于發(fā)酵。

2.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響見圖2。

圖2 時間對發(fā)酵效果的影響Fig.2 Effect of culture time on fermentation

由圖2可知，不同發(fā)酵時間對菌株T1-2和菌株P(guān)3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕具有較大影響。其中，游離氨基酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行，逐漸升高，并在第5天達(dá)到最高點(diǎn)，之后隨著發(fā)酵的延長逐漸降低。還原糖含量則在第6天達(dá)到最高。前期游離氨基酸和還原糖含量的升高，可能是由于培養(yǎng)基中接種的產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)蛋白酶菌產(chǎn)生了作用。菌株T1-2分泌的纖維素酶分解固態(tài)培養(yǎng)基中的纖維素為還原糖，菌株P(guān)3-2分泌的蛋白酶分解固態(tài)培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)為游離氨基酸，隨著發(fā)酵的進(jìn)行分游離氨基酸含量和還原糖含量別在第5天和第6天達(dá)到最大值，之后由于培養(yǎng)基環(huán)境的改變使產(chǎn)酶量降低，加上微生物的吸收利用，又使其的含量有所下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵5d時發(fā)酵效果最好。

2.4 菌種比例對發(fā)酵效果的影響

菌種比例對發(fā)酵效果的影響見圖3。

圖3 接種比例對發(fā)酵效果的影響Fig.3 Effect of inoculation proportion on fermentation

由圖3可知，菌株T1-2和P3-2的菌種比例對發(fā)酵效果具有一定的影響。按1∶1的比例可使發(fā)酵效果最好，游離氨基酸和還原糖含量都最高，菌種比例的升高或降低都會使游離氨基氮及還原糖含量降低。

2.5 接種量對發(fā)酵效果的影響

接種量對發(fā)酵效果的影響見圖4。

圖4 接種量對發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of inoculum on fermentation

由圖4可知，在菌株T1-2和P3-2混合比例為1∶1的基礎(chǔ)上，接種量對菌株T1-2和菌株P(guān)3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕具有一定影響。游離氨基酸和還原糖含量的變化趨勢基本一致，混合菌種接種量為14%時發(fā)酵效果最好，游離氨基酸和還原糖含量都最高，接種量為7%時稍次之，接種量超過21%則會使游離氨基氮及還原糖含量降低。

2.6 溫度對發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響見圖5。

圖5 溫度對發(fā)酵效果的影響Fig.5 Effect of culture temperature on fermentation

由圖5可知，溫度對菌株T1-2和菌株P(guān)3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕具有較大影響。隨著發(fā)酵溫度的升高，游離氨基酸和還原糖含量都逐漸增加，其中游離氨基酸含量在35℃發(fā)酵時最高，還原糖含量在30℃發(fā)酵時最高，之后隨著發(fā)酵溫度的升高，游離氨基氮及還原糖含量都逐漸降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為30℃時發(fā)酵效果最好。

2.7 pH值對發(fā)酵效果的影響

pH值對發(fā)酵效果的影響見圖6。

圖6 pH對發(fā)酵效果的影響Fig.6 Effect of pH value of substrate on fermentation

由圖6可知，pH值對菌株T1-2和菌株P(guān)3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕具有一定影響。其中，在pH 3～5范圍內(nèi)，還原糖含量隨著pH值的增加逐漸降低，從pH值為6開始，又逐漸升高。游離氨基酸含量隨著pH值的增加逐漸升高，在pH值為4時達(dá)到最高，之后有所下降，從pH值為6開始又逐漸升高。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值為4時發(fā)酵效果最好。

2.8 麩皮含量對發(fā)酵效果的影響

麩皮含量對發(fā)酵效果的影響見圖7。

由圖7可知，游離氨基酸的含量隨著麩皮含量的增加逐漸減少，而還原糖含量則隨著麩皮含量的增加逐漸升高。原因可能是麩皮的添加增加的基質(zhì)的透氣性，有利于產(chǎn)纖維素酶菌T1-2分泌纖維素酶，進(jìn)而降解較多的纖維素；而添加麩皮在增加透氣性的同時也降低了底物的蛋白質(zhì)含量，使得產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生菌可接觸分解的蛋白質(zhì)減少。麩皮營養(yǎng)成分很豐富，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、多種礦質(zhì)元素等成分，作為發(fā)酵基質(zhì)麩皮在發(fā)酵培養(yǎng)時有許多的作用，可作為碳氮源發(fā)酵產(chǎn)酶，還可為菌株生長代謝提供微量元素和其他生長因子。綜合考慮以上試驗(yàn)結(jié)果，麩皮含量為20%時發(fā)酵效果最好。

圖7 麩皮添加比例對發(fā)酵效果的影響Fig.7 Effect of bran addition on fermentation

2.9 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選出對發(fā)酵效果影響較大的4個主要因素：含水量A、接種量B、溫度C、時間D，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，測定其對游離氨基酸含量的影響及其最佳水平。培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

表1 培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表1和表2可知，4個因素中含水量對2株菌混合發(fā)酵餅粕后游離氨基酸含量影響最大，其次分別為接種量、溫度、時間。正交試驗(yàn)極差分析得到的培養(yǎng)條件優(yōu)化組合為A3B3C3D3，即含水量50%、接種量15%、溫度36℃、時間7d。在此最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵后游離氨基酸含量為1.68%。

3 結(jié)論

利用菌株T1-2和P3-2混合發(fā)酵蓖麻餅粕，試驗(yàn)結(jié)果表明，2株菌都不產(chǎn)胞外淀粉酶。綜合考慮游離氨基酸和還原糖含量2種指標(biāo)，單因素試驗(yàn)結(jié)果為水分含量40%，發(fā)酵時間5d，菌種比例1∶1，接種量14%，發(fā)酵溫度30℃，pH值為4，麩皮含量20%。但游離氨基酸含量的變化和還原糖含量的變化趨勢不完全一致，以游離氨基酸含量為評價指標(biāo)時，最優(yōu)培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合為含水量50%、接種量15%、溫度36℃、時間7d。在此最佳條件下，發(fā)酵后游離氨基酸含量為1.68%。

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