盧國彥，楊紅云，王少峽，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)重點實驗室，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)國家重點實驗室，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，教育部方劑學(xué)重點實驗室，天津 300193）

·實驗研究·

心腦舒通及其單體成分對內(nèi)毒素激活的小膠質(zhì)細胞的影響*

盧國彥，楊紅云，王少峽，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)重點實驗室，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)國家重點實驗室，天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室，教育部方劑學(xué)重點實驗室，天津 300193）

[目的]研究心腦舒通及其單體成分對小膠質(zhì)細胞（BV-2）的影響及其作用機制。[方法]實驗分為對照組、脂多糖刺激組、加藥組，檢測心腦舒通（不同稀釋倍數(shù)的心腦舒通及其單體成分）對小膠質(zhì)細胞活力及脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞一氧化氮（NO）產(chǎn)生的影響。[結(jié)果]心腦舒通對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞NO的產(chǎn)生無明顯抑制作用，在心腦舒通13種單體成分中，偽原薯蕷皂苷、支脫皂苷元、薯蕷皂苷元可以在不影響細胞活力的情況下抑制NO產(chǎn)生。[結(jié)論]心腦舒通部分單體成分抑制激活小膠質(zhì)細胞NO的產(chǎn)生可能是心腦舒通發(fā)揮神經(jīng)保護作用機制之一。

心腦舒通；一氧化氮；炎性介質(zhì)；小膠質(zhì)細胞

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，具有免疫防御和參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，且具有吞噬功能和一定的遷移能力，激活增殖后，可清除腦內(nèi)細胞外的氧化蛋白，吞噬細胞碎屑和破碎的髓鞘，促進組織修復(fù)[1]。在生理條件下，休眠的小膠質(zhì)細胞有平衡神經(jīng)系統(tǒng)和支持神經(jīng)細胞的重要作用。抑制小膠質(zhì)細胞過度活化所引起的炎癥反應(yīng)可以作為治療和緩解神經(jīng)退行性疾病和腦損傷的重要途徑之一[2-3]。

心腦舒通成分為蒺藜總皂苷，具有舒利血脈、平肝解郁、活血祛風(fēng)的藥理作用，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蒺藜皂苷有降血脂、抗衰老、抗脂質(zhì)過氧化作用，有改善腦循環(huán)，保護缺血腦組織的作用等[4]，其作用機制尚不明確。本實驗采用脂多糖（LPS）激活小膠質(zhì)細胞，考察其抗神經(jīng)炎癥的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑小膠質(zhì)細胞系BV-2（北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)），心腦舒通（吉林敖東股份有限公司），（25R）－26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5α-呋甾-3β，22α，26-三醇-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷（L1化合物）、?？略碥赵?3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷（L2化合物）、(25R)-5α-螺甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷和(25R)-5α-螺甾-3β,26-二醇-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)] -β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的混合物（L3化合物）、替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡糖基(1→4)-[α-L-鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷（L4化合物）（馬百平老師惠贈），其他心腦舒通單體（中新藥業(yè)），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco,USA），一氧化氮（NO）檢測試劑盒（碧云天），Cell CountingKit-8（CCK-8，DOJINDO，Japan），LPS（碧云天）。1.2實驗分組空白對照組（二甲基亞砜，終濃度V/V 1∶1 000）、LPS模型組（終濃度0.1 μg/mL）、心腦舒通（終濃度為50、10、1、0.1 μg/mL）加LPS組、心腦舒通單體（10 μmol/L）加LPS組、陽性對照（終濃度為10 μmol/L）加LPS組。

1.3心腦舒通對小膠質(zhì)細胞活力的影響調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，接種到96孔板過夜，小膠質(zhì)細胞加入不同濃度的心腦舒通（終濃度分別為50、10、1、0.1 μg/mL）及其單體（10 μmol/L）孵育24 h后棄上清，加入CCK-8（終濃度V/V 1∶10）孵育0.5 h后于450 nm處測定吸光度。

1.4 心腦舒通對小膠質(zhì)細胞NO產(chǎn)生的影響調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，接種到48孔板過夜，加入不同濃度的心腦舒通（終濃度分別為50、10、1、0.1 μg/mL）后，預(yù)孵0.5 h，然后加入LPS（終濃度為0.1 μg/mL）刺激，培育24 h后收集細胞上清，Greiss法檢測NO濃度。

1.5 心腦舒通單體對小膠質(zhì)細胞NO產(chǎn)生的影響調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，接種到48孔板過夜，加入心腦舒通單體（終濃度10 μmol/L）后，預(yù)孵0.5 h，然后加入LPS（終濃度0.1 μg/mL）。培育24 h后收集細胞上清，Greiss法檢測NO濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測心腦舒通對小膠質(zhì)細胞活力的影響結(jié)果與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），心腦舒通（0.1～50 μg/mL）沒有細胞毒作用，見表1。

表1 心腦舒通對小膠質(zhì)細胞活力的影響

2.2 Greiss法檢測心腦舒通對小膠質(zhì)細胞分泌NO的影響結(jié)果與LPS模型組相比，陽性對照組能明顯抑制NO的釋放，心腦舒通對NO的釋放沒有抑制作用。見表2。

2.3 CCK-8檢測心腦舒通單體成分對小膠質(zhì)細胞活力影響結(jié)果與空白對照組相比，偽原薯蕷皂苷、甲基原薯蕷皂苷、支脫皂苷元、海柯皂苷元、薯蕷皂苷元、L1化合物沒有細胞毒作用，纖細原薯蕷皂苷、薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、L2化合物、L3化合物、L4化合物有細胞毒作用，見表3。

表2 心腦舒通對小膠質(zhì)細胞NO的影響

表3 心腦舒通單體成分對小膠質(zhì)細胞活力的影響

2.4 Greiss法檢測心腦舒通單體成分對小膠質(zhì)細胞分泌NO的影響結(jié)果與LPS模型組相比，陽性對照組能明顯抑制NO的釋放，偽原薯蕷皂苷、支脫皂苷元、薯蕷皂苷元、L1化合物能抑制NO的釋放，L2化合物、L3化合物、L4化合物也能抑制NO的產(chǎn)生，但結(jié)合2.3，其抑制作用可能是細胞毒性產(chǎn)生的，見表4。

表4 心腦舒通單體成分對小膠質(zhì)細胞NO的影響

3 討論

心腦舒通對LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞NO的產(chǎn)生無明顯抑制作用，在心腦舒通13種單體成分中，偽原薯蕷皂苷、支脫皂苷元、薯蕷皂苷元可以在不影響細胞活力的情況下抑制NO產(chǎn)生。

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細胞，具有免疫防御和炎癥反應(yīng)[5]。脂多糖能激活休眠的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的大多數(shù)物質(zhì)，如NO、活性氧、白介素-1β等，都具有神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[6]。實驗研究表明，不影響細胞活力的前提下，心腦舒通部分單體成分能有效抑制小膠質(zhì)細胞NO的釋放[7-8]。因此，心腦舒通抑制小膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)的釋放可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一。

[1]景浩然，胡利民，王少峽，等.丹紅注射液及其活性組分對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞NO分泌的抑制作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2013，28(3):285-287.

[2]Giovannini MG,Scali C,Prosperi C,et al.Beta-amyloidinduced inflammation and cholinergic hypofunction in the rat brain in vivo:involvement of the p38MAPK pathway[J]. Neurobiol Dis，2002，11(2):257-74.

[3]van Rossum D，Hanisch UK.Microglia[J].Metab Brain Dis，2004，19(3):393-411.

[4]張錦.心腦舒通對大鼠急性多梗腦缺血的保護作用及機理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[5]Li J，Zhang SY,Lu M,et al.Hydroxysafflor yellow A suppresses inflammatory responses of BV2 microglia after oxygen-glucose deprivation[J].Neuroscience Letters，2013, 535：51-56.

[6]景浩然，柴麗娟，郭虹，等.大黃酸對內(nèi)毒素激活小膠質(zhì)細胞的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，31(1):34-35.

[7]陶冶，張允嶺，劉超，等.心腦舒通膠囊對急性腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].天津中醫(yī)藥，2008，25（6）：503-505.

[8]蔡靜，祁冰，侯麗輝，等.妍婷顆粒對脂多糖誘導(dǎo)小鼠脾細胞產(chǎn)生TNF-α的影響[J].天津中醫(yī)藥,2009,26(2): 142-144.

Effect of Xinnao Shutong and its monomer on Lipopolysaccharides activated microglia cells

LU Guo-yan,YANG Hong-yun,WANG Shao-xia,HU Li-min
（Key Laboratory of Tianjin University of TCM,State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine, Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology,Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae,Ministry of Education,Tianjin 300193,China）

[Objective]To study the effects of Xinnao Shutong and its monomer composition on microglia(BV-2)and its mechanism.[Methods]The experiment was divided into control group,lipopolysaccharide(LPS)group,dosing group.The effect of Xinnao Shutong(different dilution multiples of Xinnao Shutong and its monomer composition)on cellular activity and the production of nitric oxide(NO)in microglia cell induced by lipopolysaccharide(LPS).[Results] Xinnao Shutong could not significantly inhibit the microglia in releasing NO induced by LPS.Among the 13 kinds of monomer composition of Xinnao Shutong,Pseudoprotodioscin,Gitogenin,Diosgenin could inhibit NO secretion without affecting the cell vitality.[Conclusion]Some monomer composition of Xinnao Shutong can inhibit the releasing of NO in activated microglia.It may be one of the mechanisms of neural protection.

Xinnao Shutong;NO;inflammatory mediators;microglial cell

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.07

R285.5

A

1673－9043（2014）01－0019-03

2013-09-28）

重大新藥創(chuàng)制（2011ZX09201-201）。

盧國彥（1986-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

胡利民，E-mail:huliminth@126.com。