王莖，夏曉紅，葉敏，江莉，吳思丹

（安徽中醫(yī)學(xué)院，合肥 230038）

不同灸量艾灸對(duì)克羅恩病大鼠結(jié)腸組織損傷積分和血清IgG、IgA、IgM水平的影響*

王莖，夏曉紅，葉敏，江莉，吳思丹

（安徽中醫(yī)學(xué)院，合肥 230038）

[目的]觀察不同灸量艾灸對(duì)克羅恩病（CD）大鼠結(jié)腸組織損傷積分和血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平的影響。[方法]將45只SD大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、艾灸A組、艾灸B組和艾灸C組共5組，每組9只。采用三硝基苯磺酸（TNBS）液灌腸制備大鼠CD模型，造模后每組隨機(jī)取1只進(jìn)行模型判定。艾灸A組：艾條溫和灸雙側(cè)“天樞”穴，用小艾條點(diǎn)燃后，在穴位上方1～2 cm處溫和灸5 min，每日1次，共灸治14 d；艾灸B組：方法同艾灸A組，每次艾灸時(shí)間為15 min，共治療14 d；艾灸C組：方法同艾灸A組，每次艾灸時(shí)間為25 min，共治療14 d；模型組和正常組僅做相同固定，不做治療。治療結(jié)束后剖取結(jié)腸組織，蘇木精-伊紅染色（HE）法觀察大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化，計(jì)算結(jié)腸組織損傷積分；經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)大鼠血清IgG、IgA、IgM水平。[結(jié)果]每組取8只進(jìn)入結(jié)果分析。模型組大鼠結(jié)腸組織損傷積分以及血清IgG、IgA、IgM水平明顯上升（P＜0.01）；艾灸均能降低CD大鼠結(jié)腸組織損傷積分以及血清IgG、IgA、IgM水平，但灸治5 min效果不顯，灸治15 min和灸治25 min作用相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。[結(jié)論]合適的灸量能顯著降低血清IgG、IgA、IgM水平，調(diào)節(jié)免疫水平，抑制CD過(guò)激的免疫反應(yīng)，從而減輕CD腸道炎癥。

艾灸；克羅恩??；大鼠；結(jié)腸組織損傷積分；免疫球蛋白

克羅恩病（CD）是一種以腹痛、腹瀉、腹部結(jié)塊為主要特征的炎癥性腸病，病變后期CD患者常因腸道慢性炎癥的反復(fù)發(fā)作和組織損傷修復(fù)，出現(xiàn)腸纖維化，最終導(dǎo)致腸腔狹窄和腸壁僵硬等病理改變。目前認(rèn)為，免疫反應(yīng)是CD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，西醫(yī)主要采用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤等免疫調(diào)節(jié)劑治療，但不良反應(yīng)較大且療效欠佳[1]。本研究探索運(yùn)用艾灸治療實(shí)驗(yàn)性CD大鼠，觀察不同灸量艾灸對(duì)大鼠結(jié)腸組織損傷積分和血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的影響。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性清潔級(jí)SD大鼠45只，體質(zhì)量（180±20）g。安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模將45只大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、艾灸A組、艾灸B和艾灸C組共5組，每組9只。其中對(duì)模型組、艾灸組36只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)CD造模，模型制備參照目前國(guó)際公認(rèn)的Morris[2]法，采取三硝基苯磺酸（TNBS）溶液灌腸制備。

大鼠于造模前24 h禁食但不禁水。1）TNBS灌腸液制備：先將無(wú)水乙醇加雙蒸水，配制成50%的乙醇，再將50%乙醇與TNBS以1︰2比例混合配制成TNBS灌腸液。2）動(dòng)物麻醉：使用2%戊巴比妥鈉按照20 mg/kg進(jìn)行動(dòng)物腹腔注射麻醉。3）灌腸：造模組大鼠以TNBS溶液按100 mg/kg灌腸。大鼠體位為肛門朝上，頭朝下，以灌胃針插入肛門約6～8 cm，注入灌腸液后拔出灌胃針，保持肛門朝上體位約5 min，防止灌腸液溢出。7 d后重復(fù)灌腸1次，總計(jì)灌腸4次。4）模型鑒定：為確定CD大鼠模型制備成功，每組于造模結(jié)束后隨機(jī)抽取1只大鼠進(jìn)行結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 治療方法造模結(jié)束后進(jìn)行治療。

艾灸A組（n=8）：取天樞（雙），穴位定位根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]確定，在天樞穴行艾條溫和灸，用小艾條點(diǎn)燃后距離穴位上方1～2 cm施灸，每日1次，雙側(cè)天樞各灸5 min，共治療14 d。艾灸B組（n=8）：方法同艾灸A組，每次艾灸時(shí)間為15 min，共治療14 d。艾灸C組（n=8）：方法同艾灸A組，每次艾灸時(shí)間為25 min，共治療14 d。正常組（n=8）：不進(jìn)行任何處理，只做與治療組相同的固定。模型組（n= 8）：不進(jìn)行任何處理，只做與治療組相同的固定。

1.3 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

1.3.1 大鼠結(jié)腸組織損傷積分治療結(jié)束后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后處死動(dòng)物，約距肛門6～8 cm處截取2～3 cm長(zhǎng)結(jié)腸一段，用生理鹽水反復(fù)沖洗后，置于10%福爾馬林溶液中固定。

采用蘇木精-伊紅染色（HE）法染色后進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)觀察。取固定后的結(jié)腸組織，按照常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，然后將厚度約4 μm的石蠟切片貼片后置58℃烘箱烤片24 h，常規(guī)脫蠟至水，分別于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡各20 min，后于無(wú)水乙醇、95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各10 min，流水沖洗1 min后蘇木精襯染10 min，再水洗1 min，最后伊紅著色10 s，常規(guī)脫水并樹(shù)脂封片后，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。統(tǒng)計(jì)結(jié)腸組織損傷積分，觀察結(jié)腸炎癥、黏膜潰瘍、腺體排列、黏膜下層充血水腫及纖維增生5方面指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)以“+”號(hào)代表結(jié)腸病損程度，計(jì)算積分時(shí)每1個(gè)“+”號(hào)計(jì)1分。

1.3.2 大鼠血清IgG、IgA、IgM水平檢測(cè)大鼠麻醉后腹部朝上固定，以手術(shù)剪沿腹中線依次剪開(kāi)皮膚、皮下組織、腹膜，暴露腹腔，在腹腔正中找到腹主動(dòng)脈，右手持穿刺針，針尖斜面朝下，入針角度約25～30°，朝向心端方向刺入，深度以5 mm左右為宜,抽吸血液8～10 mL入試管內(nèi)，將試管置高速離心機(jī)內(nèi)以2 000 r/min離心15 min，取血清于-20℃冰箱保存后ELISA法檢測(cè)大鼠血清IgG、IgA、IgM含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷積分見(jiàn)表1。

表1顯示，與正常組比較，各組結(jié)腸組織學(xué)損傷積分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療組中，除艾灸A組外，其余兩組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但艾灸B組與艾灸C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠血清IgG、IgA、IgM水平見(jiàn)表2、表3、表4。

表1 各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷積分比較（±s）分

表1 各組大鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷積分比較（±s）分

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸B組比較，△P＞0.05。

組別n損傷積分正常組80.750 0±0.366 0*模型組89.125 0±0.515 4＃艾灸A組88.000 0±0.567 0＃艾灸B組84.250 0±0.250 0*＃艾灸C組84.125 0±0.226 6*?！?/p>

表2 各組大鼠外周血IgA水平比較（±s）g/L

表2 各組大鼠外周血IgA水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgA正常組80.361 3±0.184 0*模型組81.998 8±0.605 2＃艾灸A組81.313 8±0.290 3*＃艾灸B組80.630 0±0.221 8*△艾灸C組80.672 5±0.317 5*△□

表2顯示，模型組大鼠外周血IgA水平明顯上升，治療組治療后IgA水平有明顯下降，但艾灸A組與正常組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。艾灸B組與艾灸C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠外周血IgG水平比較（±s）g/L

表3 各組大鼠外周血IgG水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgG正常組80.640 0±0.294 0*模型組85.363 8±0.835 6＃艾灸A組84.388 8±0.833 7*＃艾灸B組81.188 8±0.452 9*△艾灸C組81.423 8±0.539 7*?！鳌?/p>

表3顯示，治療后各組大鼠外周血IgG水平與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但除艾灸A組外，其余兩組與正常組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療組中，艾灸A組與艾灸B組、艾灸C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），艾灸B組與艾灸C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠外周血IgM水平比較（±s）g/L

表4 各組大鼠外周血IgM水平比較（±s）g/L

注：與模型組比較，*P＜0.01；與正常組比較，＃P＜0.01；與艾灸A組比較，△P＜0.01；與艾灸B組比較，□P＞0.05。

組別nIgM正常組80.220 0±0.094 1*模型組81.227 5±0.207 8＃艾灸A組80.695 0±0.125 1*＃艾灸B組80.245 0±0.058 3*△艾灸C組80.263 8±0.048 7*△□

表4顯示，各組大鼠外周血IgM水平與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但艾灸A組血IgM水平雖有下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與艾灸B組和艾灸C組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；艾灸B組與艾灸C組血IgM水平下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

克羅恩?。–D），又稱局限性腸炎、節(jié)段性腸炎和肉芽腫性腸炎，是一種病因尚未完全明了的以末端回腸與鄰近結(jié)腸發(fā)病為多見(jiàn)的炎癥性腸病。臨床主要表現(xiàn)為慢性起病、反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、腹部腫塊、腸瘺和肛門病變，可伴有發(fā)熱、貧血、體質(zhì)量下降等全身癥狀及關(guān)節(jié)、皮膚、眼、口腔黏膜等腸外損害。重癥患者常因腸道慢性炎癥的反復(fù)發(fā)作和組織的損傷修復(fù)，導(dǎo)致腸纖維化，從而出現(xiàn)腸腔狹窄和腸壁僵硬等病理改變，使病情遷延難愈，預(yù)后不良。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的地區(qū)及城市其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[4-6]。盡管CD病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前一致認(rèn)為CD的發(fā)病與環(huán)境、免疫及遺傳等因素密切相關(guān)，上述因素引發(fā)機(jī)體及腸道組織的過(guò)激免疫反應(yīng)是CD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。臨床研究顯示，CD患者腸黏膜上皮屏障完整性受損，緊密連接被破壞，上皮細(xì)胞凋亡或壞死，腸上皮通透性增加，從而腸腔抗原反復(fù)刺激并大量攝入使腸免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別，引起免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致CD慢性腸道炎癥[7]。CD作為炎癥性腸病的一種，免疫反應(yīng)異常是其發(fā)病的重要機(jī)制[8-9]。

艾灸具有溫散寒邪、溫通經(jīng)絡(luò)、活血逐瘀、消腫散結(jié)的功效。近年來(lái)，艾灸對(duì)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及機(jī)體代謝等方面的調(diào)節(jié)作用研究越來(lái)越收到廣泛關(guān)注，尤其是艾灸對(duì)免疫功能的影響正成為目前研究的熱點(diǎn)。研究表明，灸療對(duì)免疫功能有雙向調(diào)整作用，對(duì)存在免疫障礙者可提高患者的特異性和非特異性免疫功能[10-11]，使血清中免疫球蛋白明顯增高，特異性抗體滴度增加，血清總補(bǔ)體含量升高。而對(duì)免疫反應(yīng)過(guò)激者，艾灸具有抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，糾正炎癥時(shí)自由基代謝的紊亂，改善去甲腎上腺素、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的失衡，穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境等多方面作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12]，灸療要產(chǎn)生一定療效，首先必須有一定的灸量積累，當(dāng)灸量積累到一定程度時(shí)，易產(chǎn)生灸感,獲得一定的灸感后產(chǎn)生灸效。所以，灸量是灸療起效的關(guān)鍵因素。但并非灸量越大，灸效越好，灸量與灸效之間不呈完全的線性關(guān)系。影響灸量的因素主要包括灸火勢(shì)大小、施灸時(shí)間、灸治溫度和灸治頻度等[13]。張京英等[14]觀察不同灸法、灸量對(duì)家兔全血組胺含量的影響，實(shí)驗(yàn)表明灸后90 min，各艾灸組家兔全血中組胺含量有很大差異。艾條強(qiáng)刺激時(shí),皮膚溫度達(dá)到55℃，持續(xù)5 min，全血組胺明顯升高；艾炷強(qiáng)刺激時(shí),皮膚溫度達(dá)190℃，持續(xù)90 s左右，全血組胺含量并無(wú)升高,與灸前相近；弱刺激中,艾條灸時(shí)皮膚溫度保持在40℃左右,對(duì)家兔全血組胺無(wú)影響,小艾炷灸時(shí)皮膚溫度達(dá)150℃約50 s左右，全血組胺反而明顯下降。說(shuō)明灸效與不同灸法、刺激量的大小有密切關(guān)系。過(guò)強(qiáng)（大艾炷）或過(guò)弱（艾條弱刺激）的艾火刺激均不能使血中組胺發(fā)生變化，而較強(qiáng)的（艾條強(qiáng)刺激）艾火刺激可使家兔全血中組胺明顯升高，中強(qiáng)的（小艾炷）艾火刺激可降低全血組胺的含量。李守棟[15]研究灸法不同刺激量對(duì)雷公藤甲素不良反應(yīng)的影響,結(jié)果提示不同刺激量艾灸拮抗雷公藤甲素毒性反應(yīng)的作用不同，一個(gè)中等程度的刺激更較輕刺激或強(qiáng)刺激有利于機(jī)體的臟器抵抗藥物的不良反應(yīng)。張英等[16]采用不同灸治時(shí)程治療陽(yáng)虛小鼠模型，結(jié)果顯示：不同灸治時(shí)程對(duì)陽(yáng)虛小鼠模型的T淋巴細(xì)胞酯酶陽(yáng)性率、白細(xì)胞介素2的影響存在差異,灸15 min可顯著提高陽(yáng)虛小鼠T淋巴細(xì)胞酯酶陽(yáng)性率（P＜0.01），灸5、25 min則無(wú)顯著作用；灸15、25 min均可顯著提高陽(yáng)虛小鼠白細(xì)胞介素2活性，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而灸5 min無(wú)顯著作用。

本研究選取灸治時(shí)間這一重要灸量因素治療CD顯示，CD模型大鼠外周血IgA、IgG、IgM水平明顯升高，不同灸量艾灸后，盡管各組大鼠血清IgA、IgG、IgM水平均有下降的趨勢(shì)，但艾灸B組和艾灸C組大鼠血清IgA、IgG、IgM水平下降最為明顯，且腸道炎性損傷最小，具有顯著的優(yōu)勢(shì)，艾灸B組和艾灸C組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明灸效并非與灸量完全正相關(guān)，合適的灸量能顯著降低血清IgA、IgG、IgM水平，調(diào)節(jié)免疫水平，從而抑制CD過(guò)激的免疫反應(yīng)。

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Influence of different quantity of moxibustion on colon damage and serum IgG,IgA,IgM level in rats with crohn’s disease

WANG Jing,XIA Xiao-hong,YE Min,JANG Li,WU Si-dan
（Anhui College of TCM,Hefei 230038,China）

[Objective]To explore the effects and mechanism in treating Crohn’s Disease(CD)with different quantity of moxibustion(moxi).[Methods]Forty-five rats with CD were divided into 5 groups:normal group,model group,moxi A group,moxi B group and moxi C group.At the fourteenth days after disposing,their integral score of the colon damage and the serum IgG,IgA,IgM level were observed.[Results]The integral score of the intestinal injury and the serum IgG,IgA and IgM level in model group was higher than that in the rest of group(P＜0.01),moxi can lower the integral score of colon damage,the serum IgG,IgA and IgM level and was benefited for the colon inflammatory response.But the effect of moxi for 5 min was not significant,the effect of moxi for 15 min was as significant as the effect of moxi for 25 min(P＞0.01).[Conclusion]Proper moxibustion quantity can significantly lower the integral score of colon damage and the serum IgG,IgA and IgM level,improve the immune system,alleviate the colon inflammatory changes in rats with CD.

moxibution;Crohn’s Disease;rats;the integral score of intestinal injury;immune globulin

R245.81

A

1673-9043（2014）01-0022-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.08

2013-10-16）

安徽省科技計(jì)劃2012年度重點(diǎn)項(xiàng)目（11070403060）。作者簡(jiǎn)介：王莖（1964-），男，醫(yī)學(xué)博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事針灸免疫研究。