李楠，劉志東，范麗麗，李琳，王愛潮，郭麗麗，潘衛(wèi)三

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.沈陽藥科大學，沈陽 110016）

·中藥研究·

黃芩素PLGA納米粒的體外評價及細胞相容性研究*

李楠1，劉志東1，范麗麗1，李琳1，王愛潮1，郭麗麗1，潘衛(wèi)三2

（1.天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.沈陽藥科大學，沈陽 110016）

[目的]制備黃芩素聚（乳酸-羥基乙酸）共聚物（PLGA）納米粒，并對其理化性質、體外釋藥以及體外角膜細胞相容性進行研究。[方法]使用乳化溶劑揮發(fā)法制備黃芩素PLGA納米粒，評價其性質和體外緩釋效果，主要包括：納米粒粒徑，納米粒包封率，藥物載藥量和體外緩釋曲線等。采用細胞增殖實驗評價黃芩素PLGA納米粒的細胞毒性。[結果]黃芩素PLGA納米粒粒徑（92.5±2.35）nm、Zeta電位（-21.1±2.5）mV、包封率（92.5±2.35）%、載藥量（23.12±1.45）%。體外緩釋實驗提示：突釋階段黃芩素釋放率在1 d內達（8.37±0.31）%，緩釋階段納米?？煞€(wěn)定釋放，在10 d時釋放達（51.30±0.50）%，細胞增殖實驗提示黃芩素PLGA納米粒對細胞體外生長無不良影響，細胞相容性好。[結論]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備的黃芩素PLGA納米粒具有良好的緩釋效應和良好的細胞相容性。

緩釋；PLGA納米粒；黃芩素；細胞相容性

黃芩素是黃芩的主要活性成分之一，具有抗菌[1]、抗氧化[2]、抗病毒、抗輻射、抗腫瘤[3]等藥理活性。聚（乳酸－羥基乙酸）共聚物（PLGA），通過了美國FDA認證，是一類可降解的有機聚合物，生物相容性好、無毒、無刺激性、具有緩釋特性[4]。納米粒（NP）為藥物的良好載體,PLGA常用于制備微?；蚣{米粒。本文以PLGA為載體，制備了黃芩素PLGA納米粒，考察其理化性質，體外釋藥、細胞相容等特性。

1 儀器和試藥

高效液相色譜儀（Agilent 1200，美國），KQ-300B超聲清洗器（天津Autoscience公司），Ap205電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），電動攪拌機（EWKA，德國），激光粒徑測定儀（馬爾文NanoZS，英國），超聲波細胞粉碎機（JY92-IIN寧波新型生物科技股份有限公司），高速冷凍離心機（J-25美國BECKMAN），溶出儀（ZRS-8G天大天發(fā)科技有限公司）。

黃芩素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號111595-200905），黃芩素提取物（成都歐康醫(yī)藥有限公司，含量＞95%），聚乙烯醇（PVA，天津市光復精細化工研究所），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，濟南岱罡生物科技有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS溶液，Hyclone公司），DMEM/F-12培養(yǎng)液（Hyclone公司），PAA胎牛血清（上海索萊寶生物科技有限公司），CCK-8（日本同仁化學研究所），0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）液（Sigma公司），甲醇、乙腈（天津市康科德科技有限公司，色譜純），磷酸（天津市化學試劑科貿有限公司，色譜純），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 納米粒的制備及性質考察

2.1.1 黃芩素納米粒的制備及性質考察采用乳化揮發(fā)法制備PLGA納米粒，前期實驗確定最優(yōu)處方：PVA濃度為1%，分子量15 000 PLGA（75/25），PLGA濃度20g/L，有機相中丙酮∶無水乙醇=3∶1，有機相與水相體積比為1∶50，藥物與PLGA比例為1∶40，制備PLGA納米粒。采用超速冷凍離心法測定其包封率及載藥量，激光粒徑測定儀測定其粒徑分布及Zeta電位值。將黃芩素PLGA納米粒膠體溶液稀釋50倍以后，滴至載玻片上，再滴至專用銅網(wǎng)上，使粒子在銅網(wǎng)上沉積。用透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)并照相。

2.1.2香豆素-6納米粒的制備采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備PLGA納米粒，取適量PLGA和香豆素-6溶解于一定量丙酮中作為有機相，取適量聚乙烯醇（PVA）溶于水中作為水相。在電動攪拌下，將有機相緩慢滴加到水相中。持續(xù)攪拌2～4 h，直至丙酮完全揮干，將初乳于超聲波細胞破碎儀中超聲分散，經微孔濾膜過濾后，即得香豆素-6 PLGA納米?；鞈乙篬5]。

2.2 納米粒體外釋放實驗選用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液為溶出介質，中國藥典2010版溶出度測定漿法。取黃芩素PLGA納米粒膠體溶液、與納米粒等濃度藥物溶液2 mL分別置于透析袋中，平行6份，懸于200 mL釋放介質中（100 r/min），分別于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、20 h、24 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d取樣2 mL并補同溫度溶出介質，樣品經15 200 r/min離心15 min，取上清液10 μL進樣分析[6]。

2.3 香豆素-6 PLGA納米粒眼部滯留性研究選取6只新西蘭大白兔，分別取載相同量香豆素-6的PLGA納米粒及溶液0.1 mL滴入家兔左眼結膜囊內，給藥后使家兔眼睛被動閉合8～10 s，另一側眼作為空白對照，每組平行3只。每隔15 min用裂隙燈觀察兔眼角膜表面連續(xù)熒光層強弱[7]。角膜表面連續(xù)熒光層消失的時間即為眼部滯留時間,連續(xù)測定3次。

2.4 納米粒細胞毒性實驗

2.4.1 樣品的制備按2.1項下確定的最終處方制備含藥納米粒及空白納米粒。按納米粒含藥濃度以1‰濃度二甲基亞砜（DMSO）配置黃芩素藥物溶液。所制備樣品均過濾除菌，4℃保存。

2.4.2 細胞培養(yǎng)

2.4.2.1 細胞復蘇從液氮中取出凍存的人角膜上皮細胞（HCEpic），置于37℃溫水中,并輕輕搖動凍存管,其內容物融化后,消毒，移入超凈臺開啟，采用吸管將細胞懸液移入加好全培基的培養(yǎng)瓶中，放入37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，隔天換液[8]。

2.4.2.2 細胞傳代采用10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞長至培養(yǎng)瓶底面積80%～90%時，采用0.25%胰蛋白酶EDTA液消化細胞5 min，置于倒置顯微鏡下觀察，等胞質回縮，細胞間隙逐漸增大，并有部分細胞漂起后，立即加入含10%胎牛血清的全培基培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打貼壁細胞，使細胞完全脫離瓶壁，形成單細胞懸液。800 r/min離心5 min，棄上清后加入新的完全培養(yǎng)基，細胞以1∶3比例傳代[9]。

2.4.3 CCK-8法檢測樣品對角膜上皮細胞的毒性取生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的角膜上皮細胞,用0.25%胰蛋白酶EDTA液消化,并反復吹打制備成單細胞懸液，將細胞懸液的濃度調整為105個/mL接種于96孔板，每孔體積100 μL然后將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中,在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，采用無血清培基對細胞同步化24 h。PBS溶液漂洗后，按濃度梯度在各孔中分別加入培基稀釋的藥物溶液、PLGA含藥納米粒各100 μL，培基作為空白對照，每組重復6孔，培養(yǎng)24 h后，PBS溶液漂洗后各孔加入10μL CCK-8，37℃孵育2 h后，通過酶標儀（450 nm）檢測細胞增殖活力[10]。

2.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃芩素PLGA納米粒性質采用乳化揮發(fā)法制備納米粒，納米粒的理化性質見表1。黃芩素PLGA納米粒透視電鏡照片見圖1。

表1 納米粒理化性質（±s，n=3）

表1 納米粒理化性質（±s，n=3）

項目包封率（%）載藥量（%）粒徑（nm）電位（mV）PLGA納米粒92.5±2.3523.12±1.45128.4±4.2-21.1±2.5

圖1 黃芩素PLGA納米粒透射電鏡照片

3.2 納米粒體外釋放實驗體外釋放結果見圖2。結果顯示，藥物溶液迅速從透析袋中釋放出來，24 h內釋放達（97.78±3.15）%。納米粒初期存在突釋現(xiàn)象，在第1天內釋放了（8.37±0.31）%，第2天至第10天納米粒穩(wěn)定釋放，釋放量達（51.30±0.50）%。納米粒較溶液具有明顯的緩釋特征。

圖2 藥物溶液與載藥PLGA納米粒的體外釋藥曲線（n=6）

3.3 香豆素-6 PLGA納米粒眼部滯留性研究香豆素-6 PLGA納米粒組的眼部滯留時間為（240± 30）min，香豆素-6溶液組的眼部滯留時間則為（45±15）min。PLGA納米粒的眼部滯留時間較溶液劑增加了5.3倍，顯著延長了藥物在眼部的滯留時間。

3.4 納米粒細胞毒性實驗見表2。

表2 培養(yǎng)24 h后細胞增殖情況（±s，n=6）

表2 培養(yǎng)24 h后細胞增殖情況（±s，n=6）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別劑量（μg/mL）熒光強度對照組-0.802±0.082 6藥物溶液組0.20.803±0.039 9 2 0.677±0.039 2* 200.655±0.006 7* PLGA納米粒組0.20.718±0.032 5 2 0.921±0.114 6 200.973±0.032 5*

由表2結果顯示，與對照組相比，溶液低濃度組（0.2 μg/mL）平均細胞活性無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），溶液高濃度組（20 μg/mL）、中濃度組（2 μg/mL）平均細胞活性下降，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。納米粒低、中濃度組較對照組平均細胞活性無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），納米粒高濃度組較對照組平均細胞活性增強，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。納米粒明顯提高了細胞對藥物溶液的耐受性，具有促進細胞增殖的作用。

4 討論

在體外釋放實驗中，黃芩素PLGA納米粒在37℃、pH 6.8的PBS溶液中的釋放具明顯規(guī)律性，黃芩素從納米粒中的釋放可分為兩個階段，各階段釋放行為明顯。第一階段為突釋階段[11]，主要由吸附在納米粒表面黃芩素快速釋放造成；第二階段為緩釋階段[12-13]，由于構成納米粒的PLGA緩慢降解，釋放介質逐漸擴散至納米粒內部，藥物溶解緩慢釋放出來。該階段藥物釋放時間取決于PLGA的降解速度，因PLGA在無酶條件下降解緩慢，體外持續(xù)很長時間。10 d釋放量為（51.30±0.50）%，適合長效給藥。

細胞毒性實驗結果顯示了黃芩素PLGA納米粒具有良好的細胞相容性，將藥物制備成PLGA納米粒后，細胞對藥物濃度的耐受性提高，提示該制劑類型對于提高局部藥物濃度的局部給藥研究具重要意義[14-15]。

本研究初步考察了PLGA納米粒的體外釋放及細胞相容性情況，實驗結果顯示本實驗制備的黃芩素PLGA納米粒能夠顯著延長藥物釋放時間，控制藥物平穩(wěn)釋放，可以到達臨床長效給藥目的。后期還需開展制劑體內外相關性研究。

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In vitro evaluation and cellular biocompatibility of Scutellarein-loaded PLGA nanoparticle

LI Nan1，LIU Zhi-dong1，F(xiàn)AN Li-li1，LI Lin1，WANG Ai-chao1，GUO Li-li1,PAN Wei-san2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Engineering Research Center of Modern Chinese Medicine Discovery and Preparation Technique,Tianjin Univesity of TCM,Tianjin 300193,China;2.Shenyang Phanmaceatieal University,Shenyang 110016,China）

[Objective]To prepare Scutellarein loaded PLGA nanoparticles and characterize the physicochemical properties,in vitro release behavior and biocompatibility of HCEpic cells.[Methods]The PLGA nanoparticles were prepared by emulsion solvent diffusion method.The characterization and release effect of PLGA NPs in vitro were evaluated.The main outcome measures included size,Zeta potential,Encapsulation efficiency,the drug content of the final nanoparticles etc.The in vitro release curve was drawn.The cytotoxicity of PLGA NPs were evaluated by cell proliferation assay.[Results]The particle sizes,Zeta potential,Encapsulation efficiency and the drug content of the final nanoparticles were 128.4 nm,-21.1 mV,(92.5±2.35)%and(23.12±1.45)%,respectively.The release of Scutellarein from PLGA nanoparticles were markedly reduced compared with Scutellarein solution.Cell proliferation assay revealed the PLGA-NPs did not damage the cell growth in vitro,indicating a good compatibility.[Conclusion] The PLGA-NPs prepared by emulsion solvent diffusion method have a good release effect and good biocompatibility in vitro.

controlled release;PLGA nanoparticles;Scutellarein;biocompatibility

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.01.10

R285.5

A

1673-9043（2014）01-0028-04

2013-09-20）

重大新藥創(chuàng)制-現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)和評價技術平臺建設項目（2012ZX09304007）；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-12-1068）；天津市自然科學基金項目（12JCYBJC18700）。

李楠（1982－），女，博士，從事中藥制劑方向的研究。通訊作者：潘衛(wèi)三，E-mail：ppwwss@163.com。