谷 芳，李秀麗，姚元慶

解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b抑制腫瘤血管生成的研究進(jìn)展

谷 芳，李秀麗，姚元慶

解放軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100853

研究認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因差異剪接后能夠產(chǎn)生促進(jìn)血管生成的VEGFxxx和抑制血管生成的VEGFxxxb。在VEGFxxxb家族中，VEGF165b在功能上具有代表性地位，表現(xiàn)出明顯的抑制VEGF165所介導(dǎo)的血管生成作用。由于VEGF165b具有機(jī)體自然產(chǎn)生、不具有免疫原性的優(yōu)勢(shì)，有望通過強(qiáng)制高表達(dá)、外源性給予重組蛋白或促進(jìn)VEGF外顯子8b選擇性剪接抑制腫瘤血管生成，從而用于腫瘤的治療。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；抗血管生成；腫瘤

腫瘤的生長(zhǎng)離不開新生血管的生成，血管生成是促血管生長(zhǎng)因子與抑制因子相互協(xié)調(diào)、促血管生長(zhǎng)因子增多的結(jié)果。在血管生成研究中，研究最廣泛的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。由于VEGF mRNA剪接位點(diǎn)的選擇性差異，VEGF產(chǎn)生了多種形式的VEGF剪接變異體：有促進(jìn)血管生成的VEGFxxx家族和抑制血管生成的VEGFxxxb家族，在VEGFxxxb家族中，VEGF165b無論是在功能還是在體內(nèi)分布上都占有主導(dǎo)地位[1]。2002年Bates等[2]首次從腎小球上皮細(xì)胞中分離出VEGF的一種新型剪接變異體-VEGF165b，因?yàn)轱@示出抑制VEGF165所介導(dǎo)的血管生成作用而受到廣泛關(guān)注。

1 VEGF165b的結(jié)構(gòu)和功能

VEGF基因位于染色體6p21.3，由8個(gè)外顯子構(gòu)成，并因剪接位點(diǎn)的選擇性差異產(chǎn)生了多種形式的VEGF剪接變異體，各自按其氨基酸的數(shù)目進(jìn)行命名[3]。VEGF165b由7個(gè)外顯子組成，缺少外顯子6。外顯子l編碼信號(hào)肽序列，該序列后來被信號(hào)肽酶切除而最終只形成165個(gè)氨基酸肽鏈；外顯子2編碼肽鏈的N端結(jié)構(gòu)；外顯子3、4編碼的肽鏈可識(shí)別VEGF的受體VEGFR1和VEGFR2；外顯子5編碼的肽鏈可以激活纖維蛋白溶酶；外顯子7編碼的肽鏈可結(jié)合肝素及NRP-1和NRP-2；外顯子8b編碼VEGF165b羧基末端特有的6個(gè)氨基酸。VEGF165與VEGF165b具有相同的氨基酸數(shù)目，兩者的區(qū)別僅在于氨基酸組成中羧基末端由外顯子8編碼的6個(gè)氨基酸的不同。由于選擇性剪接發(fā)生在外顯子8的近端剪接位點(diǎn)(proximal splice site，PSS)，VEGF165羧基末端的6個(gè)氨基酸為CDKPRR(Cys-Asp-Lys-Pro-Arg-Arg)，而VEGF165b的選擇性剪接發(fā)生在外顯子8的遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn)(distal splice site，DSS)，其羧基末端6個(gè)氨基酸則為SLTRKD(Ser-Leu-Thr-Arg-Lys-Asp)[4]。隨后又有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其他亞族在DSS位點(diǎn)剪接后也產(chǎn)生了相應(yīng)的抑制性VEGFxxxb亞族，包括有VEGF121b、VEGF145b、VEGF111b、VEGF183b和VEGF189b[5-7]。

2 VEGF165b的抑制腫瘤血管生成功能

腫瘤體積＞1 mm3時(shí)，腫瘤組織內(nèi)部組織液交換不能提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使得腫瘤細(xì)胞通過激活缺氧誘導(dǎo)因子1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘發(fā)腫瘤血管生成。腫瘤血管生成包括新血管出芽、血管擴(kuò)張和血管通透性改變、內(nèi)皮細(xì)胞黏附以及骨髓衍生的內(nèi)皮前體細(xì)胞摻入等過程[8]。在VEGF剪接變異體中，VEGF165顯現(xiàn)出最強(qiáng)的促血管生成作用，在黑素瘤、結(jié)腸癌和膀胱癌等腫瘤組織中過量表達(dá)；相反，VEGF165b在腫瘤組織中表達(dá)下降，而在正常組織中的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，如在后根神經(jīng)節(jié)、肺、結(jié)腸、皮膚和玻璃體中占VEGF總量的比例分別為71%、82%、95%、95%和66%，胎盤組織則是唯一特例僅為1.4%，VEGF165b表現(xiàn)出抑制VEGF165所介導(dǎo)的腫瘤血管生成的作用[9-11]。

Bates等[2]使用RT-PCR技術(shù)研究腎細(xì)胞腎癌時(shí)，首次從腎小球上皮細(xì)胞中分離出內(nèi)源性剪接變異體VEGF165b，并發(fā)現(xiàn)其能以劑量依賴方式顯著抑制VEGF165介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及腸系膜動(dòng)脈擴(kuò)張。此后，該研究小組發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞中VEGF165表達(dá)下調(diào)，在前列腺癌細(xì)胞移植瘤模型中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF165b的腫瘤與表達(dá)VEGF165的腫瘤相比生長(zhǎng)速度顯著降低[12]。Rennel等[13]使用荷瘤小鼠進(jìn)行研究表明，強(qiáng)制高表達(dá)VEGF165b不僅能顯著抑制前列腺癌、Ewing肉瘤和腎細(xì)胞癌等生長(zhǎng)，而且能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促遷移和促增殖作用。該研究小組在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，皮下注射重組VEGF165b蛋白通過直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞出芽、分裂方向及血管環(huán)結(jié)構(gòu)形成，顯著抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)并降低癌組織微血管密度；靜脈注射125Ⅰ-VEGF165b表現(xiàn)出顯著的腫瘤持久攝取至少持續(xù)24 h，并且對(duì)肝功能及血流動(dòng)力學(xué)無不良影響，為重組VEGF165b蛋白作為腫瘤抗血管治療方法奠定了基礎(chǔ)[14]。Afkhami等[15]將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF165b的HEK293細(xì)胞封裝在海藻酸鈉-多聚賴氨酸微囊里，種植在裸鼠腫瘤周圍，發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍的血管數(shù)量明顯減少。

3 VEGF165b抑制腫瘤血管生成的分子機(jī)制

VEGF165羧基末端的6個(gè)氨基酸為CDKPRR，而VEGF 165b則為SLTRKD。VEGF165b在氨基酸序列上與VEGF165相比，第160位點(diǎn)的半胱氨酸被絲氨酸取代，不能與146位點(diǎn)的半胱氨酸形成二硫鍵，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[16]。Jia等[17]在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，外顯子8編碼的羧基末端氨基酸組成和半胱氨酸的丟失造成了VEGF165和VEGF165b在結(jié)構(gòu)、受體相互作用和生物學(xué)活性等方面出現(xiàn)差異。

VEGF165、VEGFR2和輔助受體NRP-1結(jié)合能夠誘導(dǎo)VEGFR2構(gòu)型變化，使得其胞內(nèi)作用域發(fā)生旋轉(zhuǎn)，并且在受體二聚體化后使激酶作用域向二聚體內(nèi)部旋轉(zhuǎn)，引發(fā)酪氨酸自磷酸化；NRP-1作為VEGFR2的復(fù)合受體，具有增強(qiáng)VEGFR2發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的作用，VEGF165b雖然能與VEGFR2結(jié)合，但并不能與NRP-1結(jié)合，最終使得VEGFR2不能產(chǎn)生充分的旋轉(zhuǎn)效應(yīng)，致使自磷酸化效率降低[18]。也就是說，VEGF165b是VEGFR2的部分激動(dòng)劑，僅能短暫而微弱地激活VEGFR2及其下游的信號(hào)分子，從而起到抑制VEGF165介導(dǎo)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成作用。Freitas-Andrade[19]領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)研究顯示，VEGF165和VEGF165b分別與VEGFR2結(jié)合后誘發(fā)的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)存有差異，磷酸化肽位定位和位點(diǎn)特異性磷酸化抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VEGF165b僅能部分激活VEGFR2受體，但因扭轉(zhuǎn)不足而不能磷酸化位于激酶調(diào)節(jié)位點(diǎn)的第1 054位酪氨酸，致使激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)快速關(guān)閉和激酶的迅速失活，從而僅能一過性引發(fā)較弱的ERK1和ERK2磷酸化效應(yīng)。而VEGF165不僅能通過磷酸化第1 054位酪氨酸持續(xù)激活ERK1/2，還能通過磷酸化第1 175位酪氨酸激活磷脂酶Cγ和PI3K、促進(jìn)二?；视蜕桑⒛芡ㄟ^蛋白酶C依賴、Ras非依賴方式激活Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新血管生成。

4 VEGF165b在腫瘤治療方面的展望

腫瘤的生長(zhǎng)離不開新血管的生成，而VEGF起到了誘導(dǎo)和促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵作用。因此，抗血管生成治療成為臨床腫瘤治療中一個(gè)新的、有效的治療手段?，F(xiàn)有抗血管生成制劑多以VEGF-A或其受體作為分子靶點(diǎn)[20]。當(dāng)前用于卵巢癌治療的抗血管生成制劑的作用機(jī)制包括封閉或阻斷VEGF-A與其受體結(jié)合、抑制受體酪氨酸酶激活或阻斷其下游效應(yīng)分子以及破壞腫瘤血管等，但這些抗血管制劑都存在腸道穿孔、高血壓和蛋白尿等嚴(yán)重不良反應(yīng)，限制了這些藥物在臨床上的應(yīng)用[21]。Konopatskaya等[22]對(duì)小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF165b可明顯抑制視網(wǎng)膜前新生血管生成，而對(duì)生理性視網(wǎng)膜內(nèi)血管生成無抑制作用。這一點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究，如果對(duì)生理性血管沒有影響，就更加顯示出VEGF165b對(duì)于當(dāng)前應(yīng)用的抗血管生成制劑所具有的優(yōu)越性。

VEGF165b具有顯著地抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用，我們可以通過強(qiáng)制高表達(dá)VEGF165b、給予外源性重組VEGF165b或促進(jìn)VEGF外顯子8b選擇性剪接抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[23-24]。目前對(duì)VEGF165和VEGF165b的選擇性剪接調(diào)控機(jī)制的研究結(jié)果表明，多種信號(hào)途徑可影響終末端外顯子的剪接位點(diǎn)，生長(zhǎng)因子TGF-β1通過p38 MAPK-Clk/sty激酶選擇外顯子8的遠(yuǎn)端剪接位點(diǎn)，從而產(chǎn)生具有抗血管生成作用的VEGF165b家族，而這些過程可能是分別通過剪接因子SRp55產(chǎn)生作用[16]。

5 結(jié)語

VEGF165b表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤血管生成的作用，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。VEGF165b用于腫瘤的抗血管生成治療，其優(yōu)勢(shì)在于由機(jī)體自然產(chǎn)生、不具有免疫原性、對(duì)生理性血管沒有影響，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Advances in inhibitory effect of VEGF165b on tumor angiogenesis

GU Fang, LI Xiu-li, YAO Yuan-qing
Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YAO Yuan-qing. Email：yqyao@126.com

VEGF can result in angiogenesis-stimulating VEGFxxx isoforms and angiogenesis- inhibiting VEGFxxxb isoforms after the VEGF gene is differentially spliced. The function of VEGF165b has the representative position in the VEGFxxxb family. The VEGF165b plays an important role in inhibiting tumor angiogenesis due to its advantages of natural body production and nonimmunogenicity, and can thus be used in treatment of tumor by up- regulating the over-expression of exogenous recombinant protein or promoting the alternative splicing of VEGF exon 8b.

vascular endothelial growth factor 165b; vascular endothelial growth factor; anti-angiogenesis; neoplasms

R 730.23

A

2095-5227(2014)07-0770-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.035

時(shí)間：2014-03-07 11:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140307.1112.003.html

2014-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81250030)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81250030)

谷芳，女，博士。研究方向：婦科腫瘤。Email：gufang301@163.com

姚元慶，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。Email：yqyao@126.com