袁新普，周建平，李 新，高 威，董 明

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，遼寧沈陽(yáng) 110001

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

袁新普，周建平，李 新，高 威，董 明

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，遼寧沈陽(yáng) 110001

目的 探討在胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDCA)中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)的表達(dá)及臨床意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析30例胰腺癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中GRP78蛋白的表達(dá)水平，并分析GRP78的表達(dá)與患者臨床病理資料的關(guān)系。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示GRP78在癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織(73.3% vs 23.3%，P＜0.05)。單因素分析發(fā)現(xiàn)GRP78高表達(dá)的患者預(yù)后較差(P=0.009)。Western blot顯示GRP78在中低分化癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于高分化癌細(xì)胞(P＜0.05)。結(jié)論GRP78在胰腺癌組織中高表達(dá)，可能參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，GRP78高表達(dá)可能有助于判斷胰腺癌患者的預(yù)后。

胰腺癌；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；預(yù)后

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDCA)是一種侵襲性很強(qiáng)、預(yù)后很差的惡性腫瘤，5年生存率＜5%[1]。主要由于胰腺癌缺乏典型的早期癥狀，早期又容易浸潤(rùn)周圍組織、血管、神經(jīng)，同時(shí)對(duì)放化療敏感性差，因此探尋有助于早期診斷、輔助治療和判斷預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)記物成為診治胰腺癌新的突破口[2-3]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的重要一員，在蛋白質(zhì)的正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中都發(fā)揮非常重要的作用[4-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)GRP78在肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及生物學(xué)標(biāo)記方面同樣發(fā)揮非常重要的作用[7-15]。但是有關(guān)GRP78在胰腺癌中的表達(dá)及其意義，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)免疫組化和免疫印跡方法探討GRP78在胰腺癌中的表達(dá)，并分析GRP78的表達(dá)與患者的臨床病理學(xué)資料的關(guān)系。

材料和方法

1 資料 收集2006 - 2011年在我院有完整臨床資料的胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本30例，均有癌旁組織作為對(duì)照。所有患者術(shù)前均未接受放、化療治療，且術(shù)后病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌。30例中，男18例，女12例，平均年齡56.9歲。每位患者均有完整隨訪資料。

2 免疫組化 30例癌組織和30例癌旁組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋連續(xù)切片，厚度4 μm。經(jīng)0.01%枸櫞酸鹽微波抗原修復(fù)20 min，3%過(guò)氧化氫孵育15 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，1∶100稀釋的GRP78 (購(gòu)自Santa Cruz)一抗4℃過(guò)夜，滴加二抗(兔抗羊IgG)稀釋液室溫孵育30 h，現(xiàn)配的DAB進(jìn)行顯色3 min，蘇木紫復(fù)染，脫水封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果參考文獻(xiàn)[16]評(píng)分方法，兩個(gè)獨(dú)立觀察者分別進(jìn)行評(píng)分：①染色強(qiáng)度，染色弱表達(dá)1分，染色強(qiáng)表達(dá)2分。②計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占視野面積的平均百分?jǐn)?shù)，陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5% ～ 10%為1分，10% ～ 50%為2分，＞50%為3分；上述兩項(xiàng)得分的乘積為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，＞3分記為陽(yáng)性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件，癌與癌旁GRP78表達(dá)比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。不同臨床病理學(xué)參數(shù)患者GRP78蛋白表達(dá)比較采用Fisher檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)分析隨訪資料。Western blot結(jié)果應(yīng)用Image J軟件取目的蛋白在細(xì)胞中表達(dá)條帶灰度(吸光度)/ GAPDH灰度值(吸光度值)的對(duì)數(shù)值，使其呈正態(tài)分布資料后，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

圖 1 GRP78在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)Fig. 1 GRP78 expression levels in pancreatic cancer and its adjacent tissue samples

1 GRP78在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá) GRP78在胰腺癌組織中的表達(dá)率73.3%(22/30)，在癌旁組織中的表達(dá)率23.3%(7/30)，GRP78在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P＜0.05)，主要集中于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞外也有少量的表達(dá)。在癌或癌旁組織的胰島和導(dǎo)管上皮細(xì)胞中，GRP78都有較高的表達(dá)。見圖1。

2 GRP78的表達(dá)與臨床指標(biāo)及病理學(xué)的關(guān)系GRP78在中低分化的癌組織中的表達(dá)高于高分化癌組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GRP78表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位、大小、臨床分期等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3 GRP78的表達(dá)與患者術(shù)后生存的關(guān)系 單因素分析發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中GRP78陽(yáng)性表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間208.535 d，比陰性表達(dá)患者術(shù)后生存時(shí)間466.727 d有明顯的縮短，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)，見圖2。同時(shí)單因素分析發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、大小、臨床分期與預(yù)后無(wú)明確統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 2 GRP78的表達(dá)與患者術(shù)后生存的關(guān)系Fig. 2 Relation between GRP78 expression and postoperative survival time of pancreatic cancer patients

表1 GRP78的表達(dá)與臨床指標(biāo)及病理學(xué)的關(guān)系Tab. 1 Relation between GRP78 expression and clinicopathological factors (n, %)

討 論

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代末，是由細(xì)胞在無(wú)糖條件下分泌的一種細(xì)胞蛋白[8]。最初發(fā)現(xiàn)GRP78主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在線粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞外都有一定程度的表達(dá)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶中的重要一員，在促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)、錯(cuò)誤合成蛋白酶體的降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)及非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中發(fā)揮非常重要的作用[7]。GRP78在許多成人的組織器官如腦、肺、心臟中表達(dá)水平很低，但在腫瘤細(xì)胞包括泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、大腦等腫瘤組織中表達(dá)水平卻很高[10-11]。研究證實(shí)GRP78在腎癌和胃癌組織中表達(dá)明顯高于其周圍正常組織[14-15]。有關(guān)GRP78在胰腺癌中的表達(dá)目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有報(bào)道。GRP78在胰腺癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GRP78在癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞外也有一定程度的表達(dá)，這與研究一致[10,17]。結(jié)合臨床及病理學(xué)資料分析發(fā)現(xiàn)，GRP78的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度及TNM分期無(wú)關(guān)，這與GRP78在其他癌組織的報(bào)道相符[10,14,17]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在人肺癌組織中，GRP78在低分化組織中的表達(dá)高于中高分化組織[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胰腺癌中GRP78在中低分化癌組織中的表達(dá)高于高分化癌組織，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是樣本量不足、各分化型組織分布不均等原因所致。今后我們將加大樣本量，平衡各型分布進(jìn)一步明確GRP78的表達(dá)與胰腺癌病理資料的關(guān)系。

GRP78在腫瘤中的表達(dá)與患者的預(yù)后有一定關(guān)系。在食管癌和腎癌中，GRP78高表達(dá)的患者預(yù)后較低表達(dá)患者差[18-19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，GRP78癌組織中的表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)，隨GRP78表達(dá)的增高，患者的預(yù)后變差(見圖2)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步研究了GRP78在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)，隨著GRP78與胰腺癌研究的深入，GRP78可能會(huì)成為胰腺癌診治新的生物學(xué)標(biāo)記物，GRP78高表達(dá)可能有助于判斷胰腺癌患者的預(yù)后。

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Expression of glucose-regulated protein 78 in pancreatic ductal adenocarcinoma and its clinical signifcance

YUAN Xin-pu, ZHOU Jian-ping, LI Xin, GAO Wei, DONG Ming
Department of Gastrointestinal Surgery, First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

ZHOU Jian-ping. Email：zjphama@163.com

ObjectiveTo study the expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78) in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDCA) and its clinical signifcance.MethodsGRP78 expression levels in pancreatic cancer and its adjacent tissue samples from 30 PDCA patients were measured by immunohistochemistry. Relation between GRP78 protein expression levels and clinicopathological parameters of PDAC patients was analyzed.ResultsImmunohistochemistry showed that the GRP78 expression level was signifcantly higher in pancreatic cancer tissue samples than in its adjacent tissue samples (73.3% vs 23.3%, P＜0.05). Univariate analysis displayed that the prognosis was poorer in patients with a higher GRP78 expression level than in those with a lower expression GRP78 level (P＜0.05). Western blot revealed that the GRP78 expression level was signifcantly higher in poorly and moderately differentiated pancreatic cancer cells than in highly differentiated pancreatic cancer cells (P＜0.05).ConclusionHigh GRP78 expression level in pancreatic cancer tissue may participate in the development and progression of PDAC, thus contributing to predicting the prognosis of PDAC.

pancreatic cancer; glucose regulated protein 78; prognosis

R 735.9

A

2095-5227(2014)07-0744-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.027

時(shí)間：2014-04-01 17:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140401.1741.003.html

2013-12-16

遼寧省科技廳科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2013225021)

Supported by the Natural Science Foundation of Liaoning Science and Technology Committee(2013225021)

袁新普，男，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：胰腺癌的分子生物學(xué)研究。Email：yuanxin.pu@163.com

周建平，男，博士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，副主任。Email：zjphama@163.com