許文歡，阮宏華

(1.南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學，江蘇省林業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，江蘇 南京 210037)

PCR-DGGE應用于土壤生態(tài)學研究的流程及優(yōu)化

許文歡1，阮宏華2*

(1.南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學，江蘇省林業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，
江蘇 南京 210037)

土壤微生物的多樣性在生態(tài)學研究中越來越受到關注。能反映微生物多樣性的技術有很多，PCR-變性梯度凝膠電泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技術是其中的一種。此技術有其獨到特色，廣泛應用于各個領域。目前關于該技術的應用已有許多報道，然而缺少對該技術應用于土壤生態(tài)學研究詳細操作流程的歸納和總結。操作過程中有許多技術性問題，包括如何提取和純化土壤DNA、PCR反應條件設置、DGGE電泳條件設置以及圖譜數(shù)據分析等。該文簡要歸納了PCR-DGGE技術應用于土壤生態(tài)學研究的流程以及如何優(yōu)化關鍵性步驟，并提出了有待優(yōu)化的方向。

PCR-DGGE；土壤微生物； 生態(tài)學； 流程； 優(yōu)化

對于土壤生態(tài)學的研究，物質循環(huán)和物種多樣性是研究的焦點問題。在土壤中，微生物種類極其豐富，參與了各種元素循環(huán)，僅僅關注非生物的物質循環(huán)或生態(tài)研究已經無法滿足要求，因此土壤微生物的研究在土壤生態(tài)學中越來越受到重視。更多了解土壤微生物群落的分布、遺傳多樣性及其動態(tài)特征成了探索土壤微生物的必要途徑。傳統(tǒng)方法如平板分離等，局限性很多，僅有1%的環(huán)境微生物可在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)和分離，而85%～99%細菌種群不能被分離和認識[1-2]，且無法良好地反映出土壤微生物多樣性的原始特征[3]。

分子生物技術的發(fā)展，為土壤微生物多樣性方面的研究提供了重要的技術支撐。分子生物學的許多方法已應用于評價土壤微生物群落多樣性的變化[4]，如變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)、限制性酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)和末端限制性酶切片段多態(tài)性分析(T-RFLP)等。其中，PCR-DGGE技術可以更好地解析微生物生態(tài)復雜性，也可以提供生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性和群落動態(tài)性信息。目前關于該技術的應用已有許多報道，本文對PCR-DGGE在土壤微生物生態(tài)學研究中的流程及優(yōu)化進行歸納和分析。

1 PCR-DGGE的原理及其優(yōu)缺點

1.1 基本原理

PCR-DGGE是1979年由 Fischer等最先提出用于檢測DNA突變的一種電泳技術，是目前可以探知最完整環(huán)境微生物群落結構的分子生物技術?；驹硎遣煌⑸顳NA堿基序列的差異會導致微生物DNA解鏈程度不一樣，利用這一特性，將得到的DNA樣品在含有線性梯度變性劑的凝膠中進行電泳，不同DNA片段在膠體上會產生許多不同條帶。將條帶進行染色后，就能在成像系統(tǒng)中觀察到條帶，每一個條帶代表一個特定序列的DNA片段。每個樣品在各自泳道中形成條帶，在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同DNA序列，而位置差異越大，條數(shù)越多相對來說微生物種群越豐富。根據圖譜和條帶信息，可以得到微生物遺傳多樣性信息，更好地解析微生物的生態(tài)復雜性。

1.2 優(yōu)缺點

與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，這項技術可以分辨只有一個堿基差異的基因序列[5]。不僅電泳條件很好控制，操作簡便，快速，重復性好，而且只需1～5ng的DNA或RNA加樣量就可以達到很清晰的電泳效果。其最大的優(yōu)勢之一是可以同時分析多個樣品，可以檢測環(huán)境變化引起的微生物群落變化[6]。Donner等[7]利用該技術跟蹤了遠洋動態(tài)變化過程中細菌群落結構和活性的連續(xù)變化。

這項技術也具有其缺點和局限性，第1，土壤DNA提取過程除雜純化很困難；第2，DGGE技術一般要求DNA長度在500 bp以下，否則DGGE的分辨率會下降。但是如果用來判斷微生物所屬的系統(tǒng)類群，16S rDNA片段長度要求至少達到500 bp[8]。第3，不同DNA序列可能發(fā)生共遷移現(xiàn)象，因此DGGE的條帶數(shù)有可能不能正確反映被分析的混合物中不同序列的數(shù)量，有時1個條帶可能代表幾種菌，也可能不同條帶代表1種細菌。第4，染色后DNA譜帶強度有可能較弱或很不清晰。

2 PCR-DGGE的操作流程及優(yōu)化

PCP-DGGE的基本操作流程包括(1)土壤微生物總DNA的提取和純化；(2)對提取DNA的一些區(qū)段進行PCR擴增；(3)將PCR的反應產物進行DGGE分析；(4)對電泳圖譜照片進行數(shù)據分析。

2.1 土壤DNA的提取和純化優(yōu)化

從土壤中提取和純化DNA是最關鍵的技術問題之一，因為土壤中含有很多復雜難以去除的成分，如多酚類物質等。

土壤中提取微生物總 DNA 可分為2個步驟: (1) 土壤微生物細胞裂解和 DNA 提取; ( 2) DNA 純化。粗 DNA 的提取和純化都有許多不同的方法，但往往是純化得到的樣品較少，即便得到純化的樣品，也已經流失了大量DNA片段。目前土壤DNA 提取方法，主要可分為3大類，即物理方法、化學方法、酶裂解法。為了獲得更高純度的DNA，一般會結合使用這3種方法[9]。

Purohit等[10]采用pH 9.0的50 mmol/L Tris-HCl對預萃取之前的核酸進行洗滌，從而提高提取率。此外，加入苯酚或氯仿等措施也能提高DNA提取效率。趙裕棟等[9]通過比較高溫裂解法、SDS-CTAB 原位裂解法和酶裂解法這3種方法的優(yōu)缺點，同時參考提取純培養(yǎng)微生物基因組DNA 的方法，提出了優(yōu)化的土壤微生物DNA 提取方案。這種方案主要在以下幾個關鍵步驟進行了優(yōu)化處理：(1)增加了預處理步驟。先過濾，然后在裂解細胞前，加入DNA 提取液，將樣品放置在37 ℃ 搖床(180 r/min)振蕩30～45 min?？墒雇寥繢NA提取率和提取效果更佳。(2) 采用SDS-溶菌酶法裂解微生物細胞，并優(yōu)化了裂解時間和處理時間。詳細條件見原文獻。(3) 完成微生物細胞裂解后，直接加入1 /5 體積的氯仿以除去蛋白質，并防止DNA重新吸附在土壤顆粒。(4) 選 擇 20% PEG，2.5 mol/L NaCl 4 ℃ 過夜，來沉淀DNA，以減少 DNA 樣品雜質。(5)利用 PVPP 柱純化DNA 粗品。DNA樣品提取后，需要對提取效率和純度這2個關鍵性指標進行檢測。檢測DNA 樣品純度的指標有 A260 /A280，主要用來檢測蛋白質和酚類物質的污染情況，理想比值在1.8～2.0 之間；利用上述方案所得的DNA 純度較高。

騰應等[11]在研究農田土壤DNA的快速提取中，提出利用FastPrep?核酸快速提取儀和相應的Fastprep試劑盒，能夠快速釋放和純化土壤中的DNA。這個系統(tǒng)在國內應用的報道還是鮮有，其不僅具有高效、快速等優(yōu)點，同樣能得到較高純度的土壤DNA[12]。目前，大多研究采用土壤DNA提取專用試劑盒。但是，由于這類專用試劑盒純化強度往往過大，容易導致一些弱勢微生物種群的DNA信息的流失，對于多樣性研究就失去意義。因此，這方面的優(yōu)化是此技術的難點。

2.2 PCR擴增過程及優(yōu)化

在PCR擴增中，選擇合適引物至關重要。對于原核微生物的研究一般選擇16S rDNA為擴增引物比較合適，Evans 在對真菌的研究中，則采用18S rRNA。有許多研究表明，18S rRNA更能反映真菌群落特征。選擇16S rDNA有以下幾個優(yōu)勢：(1)任何一種原核生物體都具有16S rDNA，各物種具有自己的獨特序列；(2)長度適中，約1 500 個核苷酸長，適合用作分類學研究；(3)目前基因資料庫有完備的16S rDNA基因資料[1]。許多研究表明，擴增16S rDNA中可變區(qū)V3及V3～V5區(qū)的引物為最佳引物選擇區(qū)。因為V3區(qū)PCR-DGGE條帶數(shù)最多，分離效果最好[13]。DGGE檢測的DNA片段最適長度為200～900 bp，對于200 bp左右的片段(V3區(qū))分離效果最好，但缺乏分類信息；450～500 bp左右片段(V3～V5區(qū)或V6～V8區(qū))的分類信息相對更豐富[13]，如果要求較高的分類水平，應該選擇968f/1401或341/926r作為引物。Chika利用引物968f-GC和1378r擴增細菌16S rRNA，而利用引物NS1和GC擴增真菌18S rRNA。值得注意的是，常規(guī)的DGGE電泳技術對于長度超過500 bp的DNA片段序列的變化情況，檢出率僅有50%。因此要得到優(yōu)化的電泳圖像，就需要控制DNA片段序列長度在合適的范圍。

目前為了使DGGE檢出率提高到100%，通常在一側引物的5′端設計增加一段富含GC的區(qū)域。這種技術稱為“GC夾板”，其長度通常為30～50個核苷酸[13]。研究表明，使用“GC夾板”技術后，PCR產物在膠板上分離效率大大提高。

如何設置PCR的反應條件參數(shù)也是至關重要。PCR反應一般采用降落PCR策略，其常見的反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55～65 ℃退火30 s或1 min，72 ℃ 2 或3 min延伸，20個循環(huán)，其中每個循環(huán)后復性溫度降低0.5 ℃。再10個循環(huán)，反應條件同上。最后在72 ℃下延伸7或8 min。根據Gelsomino等的報道可對反應體系稍作修改[14]：將啟動溫度和時間改為95 ℃ 15 min(與熱啟動酶匹配)。真菌PCR循環(huán)參數(shù)為95 ℃預變性15 min，95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 2 min延伸，35個循環(huán)，68 ℃延伸保育10 min，后冷卻至4 ℃。

2.3 DGGE分析過程及優(yōu)化

DGGE分析過程的成功與否直接影響微生物的條帶圖譜，因此需要確定最佳電泳溫度和時間、凝膠濃度和變性劑梯度以及染色劑的選擇。

不同電泳溫度和時間對于電泳的效果會產生很大的差異，最佳解鏈溫度是由平行凝膠電泳試驗確定的，而電泳時間是由DNA的分辨情況來確定[5]。電泳溫度通常要求低于樣品解鏈區(qū)域的Tm(解鏈溫度)值，大多數(shù)DNA片段50～60 ℃比較適合。電泳時間同樣受凝膠濃度、電泳時電壓等因素影響，Muyzer等[15]提出，利用時間進程試驗，能夠確定最佳電泳時間(將待測樣品以恒定的時間間隔在同一塊凝膠上電泳，獲得樣品最大分辨率的時間)。Kauppi等[16]在D CodeTM系統(tǒng)(Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)中，對森林土樣微生物DNA擴增產物采用80V電壓，電泳16～18 h，得到了較好的效果。

凝膠濃度是根據基因片段大小確定的，當片段在200 bp時采用8%的凝膠，片段達到500 bp時用6%的凝膠 。變性劑濃度梯度可利用垂直變性梯度試驗研究DNA片段的解鏈性質，從而確定合適的變性劑梯度范圍。對于16S rDNA V3區(qū)被廣泛使用的變性劑梯度范圍是30%～60%，對不同土壤類型、不同基因片段，該范圍會有所差異。 Cycon等[17]在對土壤細菌群落進行DGGE進行分析時，利用40%～70%梯度范圍，取得了良好的條帶圖紋。而Song等[18]在對土壤真菌18S rDNA的PCR產物進行電泳時，梯度則采用了25%～45%。

另外，染色方式多種多樣，包括EB，SYBR Green I 和銀染等[19]，各有其優(yōu)缺點。目前EB染色法成本低，易操作，已成為運用最廣泛的方法，其靈敏度可以滿足一般生態(tài)學研究。而SYBR Green I染色法靈敏高，至少可檢出20 pg DNA，高于EB染色法25～100倍，價格比銀染便宜。如果需要更高的靈敏度可以使用銀染，其靈敏度比EB高200倍。王靜等[20]運用銀染獲得了較好的效果，但是銀染過后的條帶由于DNA不易回收，無法進行后續(xù)的雜交分析。

2.4 電泳圖譜照片的數(shù)據分析及優(yōu)化

目前圖譜數(shù)條帶分析軟件已很多，如Gel-Pro Analyzer，Quantity One和ImageTool等[21]。而近年來Image LabTM軟件得到越來越廣泛的應用，此軟件可以運行 Gel DocTMEZ 圖像儀以及Gel Doc XR+ 和 ChemiDocTMXRS+ 成像系統(tǒng)，能更優(yōu)化地采集和分析凝膠電泳和印跡膜的數(shù)字圖像和數(shù)據。流程如下：樣品放好后，自動化流程開始采集并優(yōu)化圖像數(shù)據，然后分析凝膠或印記膜的參數(shù)特征，最終給出詳細的報告，這一過程簡便快速只需數(shù)秒鐘，并且Image Lab軟件的應用不要求操作人員有任何成像經驗即可得到優(yōu)化的凝膠和印跡膜圖像。

通過分析軟件，可得到原始DGGE圖譜數(shù)據。利用原始數(shù)據進行深入分析，可采用許多經典的多元變量的統(tǒng)計學方法。目前最常用的方法是非加權算術平均聚類分析法(UPGMA)，可生成直觀的聚類樹。另外，多維尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)和主成分分析(Principal component analysis，PCA)也越來越多應用于圖譜分析，Araya等[22]采用MDS方法得到了細菌和真菌的動態(tài)變化圖示，很好地反應變化規(guī)律。經SPASS、SAS等常用的統(tǒng)計分析軟件可得出Shannon-Weiner多樣性指數(shù)(H’)，均勻度(E)，豐富度(R)和優(yōu)勢度(C)，這些指標可以從不同角度反映群落結構特征的量度值。也可利用Matlab(優(yōu)化程序文件獲得途徑http:emuch.net/htm1/201206/4582362.html)進行相似度、多樣性指數(shù)以及聚類分析。

3 總結

盡管PCR-DGGE已經是相對成熟的一種可分析微生物群落的多樣性及動態(tài)變化的基因指紋技術，它在應用于土壤生態(tài)學研究中仍有許多需要優(yōu)化及探索的技術問題。第1，土壤總DNA快速提取及純度優(yōu)化?？衫梦锢矸椒?、化學方法、酶裂解法有機結合得到優(yōu)化提取方案。第2，PCR反應體系及條件優(yōu)化。引物一側增加“GC夾板”可使分離效率大大提高，根據Gelsomino的報道[14]所修改的系數(shù)能得到較優(yōu)化的PCR產物。第3，DGGE過程優(yōu)化。DGGE電泳電壓和時間，農田土壤電泳可采取150V電壓6.5 h；森林土壤可采用80V電壓16～18 h。對16S rDNA V3區(qū)電泳時可使用變性劑梯度范圍30%～60%，對土壤真菌18S rDNA，梯度可采用25%～45%，針對不同環(huán)境土壤可做調整。第4，電泳圖條帶分析優(yōu)化。采用Image Lab軟件可快速得到優(yōu)化圖像數(shù)據以及凝膠或印記膜的參數(shù)特征。在樣品相似度、多樣性指數(shù)或聚類分析時，可采用Matlab優(yōu)化程序。

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ProceduresandoptimizationofPCR-DGGEapplyingtotheresearchofsoilecology

XU Wen-huan1, RUAN Hong-hua2*

(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Key Laboratory of Forestry Ecological Engineering of Jiangsu Province, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Soil microbial diversity has

more and more attention in the research of ecology.As one of the techniques which can be applied to present the diversity of microorganism, PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) has its own feature and has been widely used in various fields.So far, there were so many reports on the use of this technology but few ones on the summary of detailed operation procedures.During the operation procedures, there were some technical problems including how to extract and purify soil DNA, how to set the parameters of the conditions of PCR, how to set the condition of DGGE electrophoresis, how to analyze the atlas and data and so on.The procedures of PCR-DGGE applying to the research of soil ecology, as well as method to optimize critical procedures and the direction of optimization, were reviewed in this paper.

PCR-DGGE; Soil microorganism; Ecology; Procedure; Optimization

1001-7380(2014)04-0046-04

2014-05-09；

2014-05-26

國家自然科學基金項目(31170417)；江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程項目( CXZZ_110510)；江蘇優(yōu)勢學科建設和現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新項目；江蘇省自然科學基金青年專項項目(BK20130974)

許文歡(1991-)，男，福建泉州人，在讀碩士，研究方向：土壤生態(tài)學。

*通信作者：阮宏華(1963-)，男，教授，博士生導師，研究方向：森林生態(tài)學、土壤生態(tài)學。E-mail: hhruan@njfu.edu.cn。

S154.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.012