于樂軍　劉晨光　李立德

摘 要 開設(shè)綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，提高學(xué)生的動(dòng)手能力和創(chuàng)新意識(shí)，已成為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的總體趨勢(shì)。就中國(guó)海洋大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)開設(shè)的酸性磷酸酶綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，從選題依據(jù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容關(guān)鍵點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)心得等5個(gè)方面進(jìn)行介紹。本實(shí)驗(yàn)取材經(jīng)濟(jì)方便，操作簡(jiǎn)單易行，適合于東部沿海相關(guān)大專院校本科酶學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

關(guān)鍵詞 紫貽貝；綜合性實(shí)驗(yàn)；設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)；酸性磷酸酶

中圖分類號(hào)：G642.423 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-489X（2014）04-0106-03

酶工程是中國(guó)海洋大學(xué)生命專業(yè)生物科學(xué)及生物技術(shù)專業(yè)學(xué)生的專業(yè)選修課，經(jīng)過(guò)幾年的發(fā)展，已經(jīng)形成了學(xué)校獨(dú)特的教學(xué)理念及內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)教學(xué)一直被認(rèn)為是理論教學(xué)最好的補(bǔ)充，是聯(lián)系理論與實(shí)踐的橋梁[1]。但由于種種原因，中國(guó)海洋大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)一直處于空白狀態(tài)。雖然生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課也開設(shè)了有關(guān)酶學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足學(xué)生對(duì)于知識(shí)的渴求，以及學(xué)校加強(qiáng)實(shí)踐教學(xué)的要求。為此，經(jīng)過(guò)反復(fù)討論與實(shí)驗(yàn)，為選修酶工程實(shí)驗(yàn)的學(xué)生開設(shè)了酸性磷酸酶綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)將相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容介紹如下，希望為相關(guān)院校開設(shè)綜合性及設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)提供一些可供借鑒的經(jīng)驗(yàn)及內(nèi)容。

1 選題依據(jù)

中國(guó)海洋大學(xué)是一所以海洋和水產(chǎn)為特色的綜合性大學(xué)，正朝著建設(shè)特色顯著的高水平研究型大學(xué)高速前行。為彰顯學(xué)科特色，選擇海洋生物——紫貽貝作為實(shí)驗(yàn)材料。紫貽貝俗稱海紅、淡菜，是廣泛分布于我國(guó)東部沿海的一種常見貝類，其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且價(jià)格便宜，成本低。組織學(xué)及組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[2]，紫貽貝消化腺中含有多種酶類，又尤以酸性磷酸酶（acid phosphatase EC3.1.3.2，ACP）的活性較高。酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無(wú)機(jī)磷酸的水解酶，是溶酶體的標(biāo)志酶，而溶酶體的基本功能是對(duì)生物大分子的強(qiáng)烈消化作用，以維持細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)。在臨床上，酸性磷酸酶測(cè)定主要用于前列腺癌等疾病的輔助診斷。因此，對(duì)酸性磷酸酶的研究不但對(duì)于紫貽貝的養(yǎng)殖有一定的意義，并且對(duì)于人體一些疾病的診斷和預(yù)防也能起到積極的作用。

另外，實(shí)驗(yàn)前期，以紫貽貝酸性磷酸酶分離純化為主要內(nèi)容的兩項(xiàng)本科生SRDP項(xiàng)目已對(duì)紫貽貝酸性磷酸酶的提取、分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，實(shí)驗(yàn)過(guò)程充分展示了本實(shí)驗(yàn)的良好再現(xiàn)性，并且通過(guò)驗(yàn)收順利結(jié)題，這也為本實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌_展提供了良好的理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排

近幾年來(lái)，由于教育部《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)高等學(xué)校本科教學(xué)工作的若干意見》中明確提出了“積極推動(dòng)研究性教學(xué)，提高大學(xué)生的創(chuàng)新能力，增加綜合性與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)”的要求，許多地方高校在其專業(yè)實(shí)驗(yàn)中不同程度地開設(shè)了綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，但往往兩者之間相互獨(dú)立，自成體系，只能發(fā)揮其單一的作用。將綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)有機(jī)地結(jié)合在一起，不僅能使實(shí)驗(yàn)前后連貫，成為一個(gè)整體，而且將有助于兩者共同發(fā)揮作用，起到“1+1>2”的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)遵從這一原則，在綜合性實(shí)驗(yàn)后安排設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)是綜合實(shí)驗(yàn)的延伸和拓展，實(shí)驗(yàn)前后連貫，構(gòu)成一個(gè)整體。

先用苯酚作出酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在35 ℃下，將酶液加入盛有磷酸苯二鈉溶液的試管中，精確反應(yīng)10 min，加入1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，再加入Folin-酚試劑，35 ℃精確反應(yīng)10 min，同時(shí)以不加酶液，但反應(yīng)條件一致的另一試管作為空白對(duì)照，測(cè)定在OD680 nm下的吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出樣品吸光度所對(duì)應(yīng)的結(jié)晶酚濃度，通過(guò)相應(yīng)公式計(jì)算酶活力。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過(guò)測(cè)定染料在595 nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡(jiǎn)單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高。

酸性磷酸酶米氏常數(shù)Km的測(cè)定 測(cè)定Km和Vm，特別是測(cè)定Km，是酶學(xué)工作的基本內(nèi)容之一。在酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的分析中，米氏常數(shù)Km是酶的一個(gè)基本特性常數(shù)，它包含著酶與底物結(jié)合和解離的性質(zhì)。米氏常數(shù)的測(cè)定一般通過(guò)作圖法求得。作圖方法很多，其共同特點(diǎn)是先將米氏方程式變換成直線方程，然后通過(guò)作圖法求得。本實(shí)驗(yàn)采用最常用的雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk作圖法）求得。

酸性磷酸酶凝膠過(guò)濾柱層析 凝膠過(guò)濾層析也稱分子篩層析、排阻層析，是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離的一種層析方法。本實(shí)驗(yàn)選取葡聚糖凝膠Sephadex G-150作為凝膠填料，用0.01 mol/L醋酸緩沖液作為洗脫液進(jìn)行凝膠過(guò)濾柱層析。

酸性磷酸酶凝膠電泳 酸性磷酸酶凝膠電泳采用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）垂直板電泳，濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和10%，其中關(guān)鍵的樣品溶解緩沖液體系包括：1.0 mol/L，pH6.8 Tris-HCl緩沖液0.5 ml、甘油0.8 ml、10% SDS 1.6 ml、2-巰基乙醇0.4 ml、0.05%溴酚藍(lán)0.2 ml和蒸餾水（雙蒸水）4.5 ml，總體積8 ml[3]。

酸性磷酸酶固定化 綜合實(shí)驗(yàn)中酶固定化采用物理吸附法，使用活性炭作為吸附劑，將酶液吸附后，經(jīng)離心得到的沉淀即為固定化酶。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中要求學(xué)生以來(lái)源于海洋生物的兩種材料——海藻酸鈉和殼聚糖為固定化材料，設(shè)計(jì)酶固定化實(shí)驗(yàn)。

酸性磷酸酶性質(zhì)研究 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)酸性磷酸酶性質(zhì)研究主要包括溫度、pH值、熱穩(wěn)定性、金屬離子、化學(xué)修飾劑對(duì)酶活力的影響。要求每組學(xué)生至少設(shè)計(jì)兩種因素對(duì)酶活力的影響，并且各組間盡量不要重合。

4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)心得

1）本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是以酸性磷酸酶為主線，運(yùn)用了離心、分光光度、層析技術(shù)、電泳技術(shù)、透析等酶工程相關(guān)專業(yè)技術(shù)對(duì)紫貽貝酸性磷酸酶進(jìn)行提取、分離純化到固定化的綜合性實(shí)驗(yàn)，并在綜合實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開設(shè)兩個(gè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)不是獨(dú)立于整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系外，而是整個(gè)體系的延伸和拓展，使整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程前后連貫，構(gòu)成一個(gè)完整的整體。這樣將綜合性實(shí)驗(yàn)與設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，不僅有利于培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)動(dòng)手能力和綜合分析能力，而且有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力及創(chuàng)新意識(shí)，更有利于調(diào)動(dòng)學(xué)生對(duì)酶工程實(shí)驗(yàn)的積極性及主動(dòng)性，從而達(dá)到“1+1>2”的效果。

另外，設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)與綜合性實(shí)驗(yàn)構(gòu)成一個(gè)整體，也使得學(xué)生在查閱相關(guān)資料、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案時(shí)有的放矢，提高設(shè)計(jì)方案的可行性，為取得良好的實(shí)驗(yàn)效果奠定基礎(chǔ)。

2）本實(shí)驗(yàn)的實(shí)施采用“開放自主式”的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?。開放自主式實(shí)驗(yàn)教學(xué)能使學(xué)生從“被動(dòng)、封閉、受束縛”的狀態(tài)變成“主動(dòng)、開放、較自由”的狀態(tài)，真正地成為實(shí)驗(yàn)的主人、教學(xué)的主體，充分地鍛煉了學(xué)生“大腦”和“雙手”[4]。由于中國(guó)海洋大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室采用門禁系統(tǒng)管理，因此將學(xué)生的智能卡開卡后，學(xué)生可隨時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，這就保證了實(shí)驗(yàn)室全天候的開放。在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，學(xué)生從實(shí)驗(yàn)材料的購(gòu)買、實(shí)驗(yàn)試劑的配制、實(shí)驗(yàn)儀器的組裝，到設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)的方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)的操作，都自主完成，教師只起到掌控全局、適時(shí)指導(dǎo)和適當(dāng)監(jiān)督的作用[5]。

3）實(shí)驗(yàn)分成若干個(gè)小組，并且采取組長(zhǎng)負(fù)責(zé)制。由于本次大實(shí)驗(yàn)的實(shí)施是在學(xué)生上課階段，因此不是每個(gè)學(xué)生都有時(shí)間在同一時(shí)間內(nèi)做實(shí)驗(yàn)。這就要求組長(zhǎng)進(jìn)行協(xié)調(diào)和分配，整個(gè)小組成員相互協(xié)作，做好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃安排，保證實(shí)驗(yàn)在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)高質(zhì)量、高水平地完成。同時(shí)也鍛煉了學(xué)生在組織協(xié)調(diào)及相互協(xié)作方面的能力。

4）在酶學(xué)固定化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，海藻酸鈉和殼聚糖兩種材料可單獨(dú)作為包埋材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，也可兩種材料結(jié)合起來(lái)，設(shè)計(jì)兩種材料的復(fù)合微球。最后，將幾種固定化酶的效果進(jìn)行比較，這樣做不僅使學(xué)生更加直觀地掌握了幾種固定化方法，而且有利于提高學(xué)生在綜合知識(shí)方面的能力。

5）實(shí)驗(yàn)安排時(shí)，不是簡(jiǎn)單地羅列出實(shí)驗(yàn)步驟，而是在每個(gè)實(shí)驗(yàn)后面附有2～3個(gè)思考題。比如在酶活測(cè)定時(shí)，思考題為：如果用定磷法設(shè)計(jì)酶活實(shí)驗(yàn)，該如何設(shè)計(jì)？再如在酶的凝膠電泳時(shí)，思考題為：如果樣品不用還原劑處理，電泳結(jié)果將會(huì)如何？這些問(wèn)題的提出，有助于學(xué)生主動(dòng)去思考問(wèn)題、解決問(wèn)題，并將其更好地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中，調(diào)動(dòng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的積極性和主動(dòng)性。

5 結(jié)束語(yǔ)

隨著各高校對(duì)教育部《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)高等學(xué)校本科教學(xué)工作的若干意見》的進(jìn)一步落實(shí)，開設(shè)綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，提高學(xué)生的動(dòng)手能力和創(chuàng)新意識(shí)，已成為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的總體趨勢(shì)[6-8]。綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)總體方案的設(shè)計(jì)應(yīng)該具有連貫性、系統(tǒng)性、科學(xué)性和實(shí)用性，并且要經(jīng)常在原有基礎(chǔ)上拓展新的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。只有這樣，才能不斷調(diào)動(dòng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)的積極性和主動(dòng)性，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新精神。

未來(lái)，還要在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深化和拓展，比如酶的克隆與表達(dá)、酶的定向進(jìn)化、酶的中試生產(chǎn)、酶的應(yīng)用等方面，力爭(zhēng)使本綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)涵蓋酶工程上、中、下游的各個(gè)方面，為國(guó)家和社會(huì)培養(yǎng)具有專業(yè)酶工程知識(shí)和技術(shù)的高素質(zhì)人才。

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