譚衛(wèi)荷 佘 芹 郭曉燕 李付廣 張金云 湯素環(huán)

（廣東省清遠市人民醫(yī)院，廣東 清遠 515500）

MLPA在診斷1例復(fù)雜性先天性心臟病中的應(yīng)用

譚衛(wèi)荷 佘 芹 郭曉燕 李付廣 張金云 湯素環(huán)

（廣東省清遠市人民醫(yī)院，廣東 清遠 515500）

目的采用多重連接探針擴增技術(shù)（MLPA）對臍帶血標本進行進行檢測，分析在復(fù)雜性先天性心臟病診斷中應(yīng)用的診斷價值。方法①對1例復(fù)雜性先天性心臟異常胎兒取臍帶血3 mL臍帶血細胞進行培養(yǎng)和標本制作，利用G顯帶技術(shù)對染色體核進行分析；②并取200 μL提取DNA后采用MLPA技術(shù)進行檢測。結(jié)果G顯帶染色體核型分析46，XY，MLPA 檢測結(jié)果為與先天性心臟病相關(guān)的2個探針對應(yīng)的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現(xiàn)減半，統(tǒng)計缺失區(qū)域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3）。結(jié)論患兒在與先天性心臟病相關(guān)的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。

復(fù)雜性先天性心臟?。欢嘀剡B接探針擴增

先天性心臟病是一種多基因遺傳病，所涉及的基因在表達質(zhì)或量上的異常都可能影響心臟發(fā)育，導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。本文對1例復(fù)雜性先天性心臟異常兒取臍帶血，對臍帶血細胞進行培養(yǎng)染色體核型分析，同時提取DNA后采用MLPA技術(shù)進行檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象

龔紅麗之子，2011年03月25日順產(chǎn)出生，出生時宮內(nèi)妊娠40+1周，羊水清，無窒息，阿氏評分10-10-10分，體質(zhì)量2600g，輕微唇裂，尿道閉鎖，肛門無異常，余外觀未見異常，心臟聽診無明顯雜音，出生前B超提示單心房，單心室。出生后新生兒行心臟彩超檢查，診斷：單心房，單心室，二尖瓣閉鎖，永存動脈干，動脈導(dǎo)管未閉，輕度三尖瓣關(guān)閉不全，以上資料的獲得均經(jīng)患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析

按常規(guī)方法抽取3 mL臍帶血細胞進行培養(yǎng)和標本制作，利用G顯帶技術(shù)對染色體核型進行分析，根據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）（2005）》描述染色體核型。

1.2.2 MLPA分析

①基因組DNA的提?。喝√耗殠а?00 μL，采用QIAamp DNA Mini Kit （Qiagen），嚴格按照規(guī)定提取DNA，并測定其在260 nm和 280 nm處的吸光度值，再計算出DNA的純度與濃度，要求A260/A280在1.8～2.0。最后使用TE緩沖液（pH=8）把DNA稀釋到100 ng/μL。②MLPA檢測：選用荷蘭MRC Holland公司MLPA Mental Retardation-1試劑盒（SALSA P311；MRC-Holland）中31個與先天性心臟病相關(guān)區(qū)域的探針（序列見P311說明書）。MLPA操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，取100 ng的基因組DNA，在95 ℃的環(huán)境中存放5分鐘，后取出與SALSA探針P311均勻混合，再置于95 ℃的環(huán)境中1 min，然后將溫度調(diào)至60 ℃雜交16 h，在54 ℃的環(huán)境中使用連接酶連接15 min后，在98 ℃孵育5 min后停止反應(yīng)，并使用SALSA FAM PCR體系使PCR得到擴增。在PCR產(chǎn)物中選取1 μL樣品，采用測序儀對其進行片段分析，并使用正常人的標本與每次反應(yīng)對照，使用GeneMarker 1.71軟件處理得到的結(jié)果，計算片段擴增或缺失的情況。MRC-Holland 定義探針正常比值范圍為0.7～1.3。

2 結(jié) 果

圖1 患兒MLPA篩查結(jié)果。藍色點代表內(nèi)參探針，綠色點與紅色點代表與先天性心臟病相關(guān)的探針（紅色點為異常），如圖示探針長度在229，362nt位置探針峰值比明顯降低

圖2 患兒MLPA篩查結(jié)果。藍色峰代表樣本，紅色峰代表正常對照，顯示探針長度在229，362nt位置探針峰值明顯降低

2.1 G顯帶染色體核型分析

染色體G顯帶核型分析46，XY。

2.2 MLPA檢測結(jié)果

本研究病例的MLPA驗證結(jié)果，與先天性心臟病相關(guān)的2個探針對應(yīng)的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現(xiàn)減半，統(tǒng)計缺失區(qū)域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3），根據(jù)診斷標準，可判斷患兒在與先天性心臟病相關(guān)的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。見圖1和圖2。

3 討 論

先天性心臟病是一類胚胎期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所引起的先天畸形，在出生后存活嬰兒中的發(fā)生率為0.3%～1.0%，在流產(chǎn)兒和死胎中則高達10.2%[1]。是一種多基因遺傳病，主要是由于胚胎期遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致心臟血管異常發(fā)育所引起的。

研究報道，GATA4是與心臟發(fā)育密切相關(guān)的一種特定細胞核轉(zhuǎn)錄因子，它在心臟前體細胞分化、心臟發(fā)育、心肌肥厚和抗凋亡等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2]，GATA4基因突變可引起心臟異常發(fā)育，若GATA4的功能減弱，內(nèi)胚層細胞不會正常分化，則導(dǎo)致心臟發(fā)生異常。GATA4基因突變的致病機制可能包括轉(zhuǎn)錄因子對靶DNA 結(jié)合親和力下降、下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性降低或其他輔因子相互作用缺失[3-4]。本病例的MLPA驗證結(jié)果，與先天性心臟病相關(guān)的2個探針對應(yīng)的片段大小位置在3100的電泳圖上熒光峰值相比正常對照明顯出現(xiàn)減半，見圖1，統(tǒng)計缺失區(qū)域的熒光比值為0.450和0.339（正常值：0.7～1.3），根據(jù)診斷標準，可判斷患兒在與先天性心臟病相關(guān)的基因位點（GATA4）的上游存在雜合性缺失，缺失的片段大小約為1.5kb。由于基因片段缺失，導(dǎo)致單心房，單心室，二尖瓣閉鎖，永存動脈干，動脈導(dǎo)管未閉，輕度三尖瓣關(guān)閉不全，結(jié)果表明GATA4基因異常是導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的主要原因。

[1] 徐小延,邱廣蓉,宮立國,等.GATA4基因與單純性先天性心臟病的相關(guān)性研究[J].中國實用兒科雜志,2007,22(8):587-590.

[2] 陳名武,劉唐威,龐蓋生.轉(zhuǎn)錄因子GATA4在心血管系統(tǒng)中作用的研究進展[J].中華心血管雜志,2008,36(1):44-45.

[3] Xin M,Davis CA,Molkentin JD,et a1.A threshold of GA7 4 and GATA6 expression is required for cardiovascular development[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(30):11189-11194.

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1671-8194（2014）13-0316-02