劉寧華繆月娥亓發(fā)芝 顧建英△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系聚合物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200433)

不同比例聚乳酸-聚己內(nèi)酯/泊洛沙姆靜電紡納米材料作為皮膚支架的可能性

劉寧華1繆月娥2亓發(fā)芝 顧建英1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系聚合物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200433)

目的探討不同比例聚乳酸-聚己內(nèi)酯/泊洛沙姆［poly(ε-caprolactone-co-lactide)/Poloxamer,PLCL/ Poloxamer］靜電紡材料作為皮膚組織支架的可能性。方法靜電紡絲技術(shù)制備純PLCL及PLCL/Poloxamer比例75/25、85/15、90/10、95/5的納米纖維材料,測(cè)定支架表面形態(tài)、機(jī)械以及親水性能。將脂肪干細(xì)胞接種至支架表面,第1、3、7、10天行水溶性四唑鹽(CCK-8)分析,并于第3天掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果90/10、95/ 5比例支架的斷裂強(qiáng)度高于純PLCL及75/25、85/15比例支架(分別為9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21, 7.46±0.27和7.47±0.21,MPa),90/10、85/15、75/25比例的水接觸角低于純PLCL及95/5比例(分別為0°, 0°,0°,131.5°±8.9°和7.8°±2.7°)。在第1、3、7、10天時(shí),PLCL/Poloxamer材料脂肪干細(xì)胞黏附及增殖能力明顯高于純PLCL。掃描電鏡顯示90/10比例PLCL/Poloxamer支架上有大量脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)完整、表面光滑。結(jié)論90/10比例PLCL/Poloxamer支架的機(jī)械性能及親水性能高于其他組,該材料與大鼠脂肪干細(xì)胞的相容性良好,是更適合脂肪干細(xì)胞黏附及增殖的組織工程材料。

脂肪干細(xì)胞； 靜電紡絲； 皮膚； 聚乳酸-聚己內(nèi)酯/泊洛沙姆； 掃描電鏡

對(duì)于嚴(yán)重?zé)齻驒C(jī)械傷致大面積的皮膚組織缺損,目前臨床上常采用自體皮瓣或皮片移植來進(jìn)行修復(fù),但是由于自體皮瓣或皮片的組織量有限,尚無法滿足臨床的應(yīng)用。因此,臨床上常采用人工組織工程皮膚來修復(fù)。采用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建的組織工程支架厚度可在0.05～2 mm之間,與皮膚表皮層及真皮層的厚度一致,這使得靜電紡的材料在幾何尺寸上與細(xì)胞外基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)存在一致性［1-2］。聚乳酸-聚己內(nèi)酯［poly(ε-caprolactone-co-lactide, PLCL)］是一種人工合成的高分子聚合材料,它取材廣泛、容易降解,同時(shí)具有良好的柔韌性、抗磨損性和一定的機(jī)械強(qiáng)度,近年來被較廣泛地應(yīng)用于組織工程的支架［3-4］。但PLCL親水性不夠,尋找一

種材料與之共紡成為必要。泊洛沙姆(Polomaxer)是聚氧乙烯共聚物,是一類新型的高分子離子表面活性劑,常用作藥物輔劑,其毒性小、無色,具有兩端親水、中間疏水的特性［5-6］。我們采用靜電紡絲技術(shù)制備純PLCL及比例為75/25、85/15、90/10、95/ 5的PLCL/Poloxamer納米纖維材料,檢測(cè)支架表面形態(tài)、機(jī)械性能以及親水性等特性,并將脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)接種在不同配比的靜電紡納米支架上,體外觀測(cè)其生物組織相容性,篩選一種最佳配比的PLCL/Polomaxer納米材料,以期作為修復(fù)皮膚創(chuàng)面的組織工程材料。

材料和方法

儀器試劑PLCL(聚乳酸-聚己內(nèi)酯,山東濟(jì)南岱罡生物科技有限公司公司,其聚乳酸與聚己內(nèi)酯比值為7∶3)。Polomaxer(泊洛沙姆,復(fù)旦大學(xué)材料學(xué)院提供)。靜電紡絲設(shè)備(Onizuka Glass公司,日本),攪拌器(BT124 S,北京賽多利斯),拉力測(cè)試儀(CMT8501型,深圳新三思集團(tuán)),水接觸角測(cè)試儀(OCA40,Dataphysics,德國(guó)),掃描電子顯微鏡(JSM-5600LV,日本),酶標(biāo)儀(RT-6000,美國(guó)),正置、倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)。磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(1∶1)(中國(guó)吉諾生物有限公司)。低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)。CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)。六氟異丙醇、Ⅰ型膠原酶、二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司)。

脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞來自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的SD大鼠,按照Yoshimura等［7］介紹的方法,常規(guī)備皮、消毒、鋪巾,用20號(hào)刀片平行于腹股溝方向切開皮膚,眼科剪將腹股溝脂肪分離并取出,置于無菌生理鹽水中,并盡快分離細(xì)胞。在顯微鏡下將脂肪組織內(nèi)的小血管挑取出來,置于玻璃板上,用眼科剪反復(fù)裁剪成1 mm3大小的碎片。移入消化瓶后加入4倍體積的0.1%I型膠原酶,搖勻密封后置入37°的恒溫?fù)u床中消化1 h。消化結(jié)束后,用200目濾網(wǎng)過濾未消化組織碎片,將濾液移入15 m L離心管中400×g離心5 min,棄上清液,加入7～8 m L PBS吹勻細(xì)胞后400 ×g再次離心5 min,棄上清液后吸取低糖DMEM 4～5 m L(10%胎牛血清,青霉素和鏈霉素含量100U/m L)滴入離心管吹打細(xì)胞,將細(xì)胞移入25 cm2培養(yǎng)瓶中并置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。2天換一次液,原代培養(yǎng)第6天時(shí)細(xì)胞達(dá)到80%融合,用0.25%胰酶-0.02%EDTA(1∶1)消化傳代。第3代為目的細(xì)胞,即脂肪干細(xì)胞。

pLCL/polomaxer靜電紡絲納米材料制備將各比例的PLCL、Polomaxer溶解在六氟異丙醇溶劑中,在磁力攪拌器下溶解4～6 h成穩(wěn)定均一透明的溶液,靜置30 min后備用。共混靜電紡絲實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行,將紡絲液吸入1支1.0 m L或2.5 m L的注射器,注射器金屬針頭內(nèi)徑為0.42～0.58 mm,通過包有絕緣皮的電線和鐵頭將靜電高壓發(fā)生器(可以提供0～50 k V的直流電壓)和針頭連接起來,將一片鉆箔用雙面膠粘到硬紙板上,然后放置到針頭正下方12～15 cm處,作為接地的接收器,用于接收靜電紡纖維。在高電壓作用下,紡絲液在電場(chǎng)中噴射形成纖維沉積在接收器上,形成纖維膜。

支架掃描電鏡檢測(cè)將收集在鋁箔上的靜電紡纖維試樣鍍金90 s,然后在10 k V加速電壓下,用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察靜電紡纖維的形態(tài)并拍照。為了統(tǒng)計(jì)不同樣品的納米直徑分布范圍,將所得的SEM圖像用圖像分析軟件Image J對(duì)制備的納米纖維進(jìn)行直徑測(cè)量。

支架力學(xué)性能測(cè)定將電紡所得的厚度一定(100μm)、不同比例的PLCL/Polomaxer電紡膜裁成5 mm×50 mm的長(zhǎng)條形樣條,在拉伸儀上于室溫下進(jìn)行單軸拉伸試驗(yàn),微調(diào)機(jī)頭位置待電紡材料略微張緊后開始拉伸測(cè)試。拉伸速度為20 mm/ min。重復(fù)檢測(cè)5個(gè)樣本。

支架水接觸角測(cè)定采用100μm平整的不同比例的PLCL/Polomaxer材料,測(cè)試時(shí)水滴體積為3μL,測(cè)試環(huán)境為室溫。通過光學(xué)顯微鏡的攝像頭觀察水滴在片材表面的變化情況,接觸角由圖象分析軟件自動(dòng)測(cè)定。選用的測(cè)定頻率為2 Hz,得到樣品的水接觸角情況。重復(fù)檢測(cè)5個(gè)樣本。

靜電紡絲支架的細(xì)胞種植將支架材料均剪成直徑為7 mm的圓形支架,紫外燈照射1 h后,浸泡于75%酒精中消毒12 h,取出后用PBS反復(fù)沖洗3次,每次5 min,晾干備用。將圓形支架置于96孔板內(nèi),鋪平于孔板底,加入50μL低糖DMEM預(yù)濕12 h。調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/m L,吸取20μL細(xì)胞懸液加在材料表面,并充分搖勻,使得細(xì)胞懸液能接觸到材料的所有表面,同時(shí)空白孔加入細(xì)胞懸液20μL作為對(duì)照,然后將孔板置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,4 h后加入低糖DMEM(10%FBS, 100 U/m L青霉素和鏈霉素)80μL繼續(xù)培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。

CCK-8檢測(cè)從加入細(xì)胞懸液開始計(jì)時(shí),分別在細(xì)胞培養(yǎng)的第1、3、7和10天加入10μL CCK-8反應(yīng)液,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,震蕩混勻后從各孔內(nèi)吸取出混合液體100μL轉(zhuǎn)入另外的96孔板內(nèi),用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量450 nm處吸光度(D)值,第1天和第3天數(shù)值反應(yīng)細(xì)胞與支架的黏附情況,第7天和第10天數(shù)值反應(yīng)細(xì)胞在支架上的增殖情況。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

ADSCs與pLCL/polomaxer體外培養(yǎng)掃描電鏡觀察脂肪干細(xì)胞與純PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer材料培養(yǎng)3天后取出,采用鋨酸固定,丙酮梯度脫水的方法處理樣品,預(yù)冷臨界點(diǎn)干燥儀將樣品干燥后,用導(dǎo)電膠將樣品固定在電鏡臺(tái)上。噴金后(10 m A,90 s)在真空掃描電鏡上進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各項(xiàng)定量指標(biāo)均以x—±s的形式表示,應(yīng)用SPSS 16.0軟件包對(duì)各定量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,不同材料組之間的各觀察值用單因素方差分析(ANOVA),比較不同時(shí)間點(diǎn)不同組間的各觀察值采用單個(gè)重復(fù)測(cè)量因素方差分析(analysis of variance of repeated measures data),多重比較采用最小顯著差值法(Least-significant difference, LSD)。當(dāng)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同配比pLCL與polomaxer掃描電鏡及纖維直徑檢測(cè)掃描電鏡結(jié)果見圖1 A-E,可見所得靜電紡絲材料纖維表面光滑。除PLCL/Polomaxer比例75/25支架出現(xiàn)纖維融合外,其余各組纖維形態(tài)清晰,且直徑的變異系數(shù)變化不大。通過Image J軟件測(cè)量支架纖維直徑,75/25 PLCL/Polomaxer纖維直徑為(2.74±1.22)μm,明顯大于PLCL、85/ 15、90/10和95/5組支架［分別為(1.58±0.47) μm、(1.60±0.65)μm、(1.55±0.39)μm和(1.61 ±0.52)μm,P＜0.05］,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組的纖維直徑差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同配比pLCL與polomaxer力學(xué)性能測(cè)量結(jié)果力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果提示不同配比PLCL與Polomaxer的力學(xué)測(cè)量提示各組分之間的拉伸模量差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均在正常皮膚范圍以內(nèi)。90/10、95/5的PLCL/Polomaxer的拉伸強(qiáng)度均大于單純PLCL、75/25、85/15等組,差異存在顯著性,但這兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各組分的拉伸強(qiáng)度均在正常皮膚范圍以內(nèi)。90/10、95/5的PLCL/ Polomaxer的斷裂伸長(zhǎng)率兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但均大于PLCL組,小于75/25、85/15等組,各組的斷裂伸長(zhǎng)率均高于正常皮膚范圍(表2)。

不同配比pLCL與polomaxer水接觸角測(cè)量結(jié)果水接觸角測(cè)量結(jié)果提示純PLCL材料的接觸角為131.5°±8.9°；75/25、85/15及90/10的水接觸角為0°；95/5水接觸角為7.8°±2.7°(圖2)。

CCK-8檢測(cè)ADSCs在PLCL/Polomaxer各組支架上培養(yǎng)后第1天,Control、PLCL、75/25、85/ 15、90/10、95/5等組的D值分別為0.20±0.06、0.19±0.04、0.35±0.11、0.33±0.05、0.35±0.16、0.31±0.09。培養(yǎng)后第3天,D值分別為0.44± 0.08、0.36±0.10、0.67±0.16、0.64±0.09、0.69± 0.07、0.59±0.16。培養(yǎng)后第7天,D值分別為1.13 ±0.14、0.78±0.21、1.47±0.11、1.51±0.21、1.54 ±0.23、1.49±0.17。培養(yǎng)后第10天,D值分別為1.47±0.09、1.23±0.16、1.73±0.10、1.79±0.35、1.72±0.33、1.80±0.18(圖3)。

采用重復(fù)測(cè)量的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí),不同方法間的結(jié)果存在差別(F=18.308, P＜0.01)。通過LSD兩兩比較,Control組與PLCL組和75/25、85/15、90/10、95/5等組的D值之間存在差異,P值分別為0.019,0.01,0.01,0.01,0.02；

(1)vs.PLCL and control group；(2)vs.PLCL group,P＜0.05.Cell number of ADSCs on 75/25,85/15,90/10 and 95/5 PLCL/Polomaxer is greater than PLCL and control group at day 1, 3,7 and 10；Cell number of ADSCs on control group is greater than PLCL group at day 3,7and 10. PLCL組與75/25、85/15、90/10、95/5等組的D值之間存在差異,P值均＜0.01；75/25、85/15、90/10、95/ 5等組的D值之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均＞0.05。

ADSCs在pLCL/polomaxer材料上的掃描電鏡觀察結(jié)果ADSCs在純PLCL、85/15、90/10、95/5 PLCL/Polomaxer納米材料上培養(yǎng)第3天時(shí),將細(xì)胞與支架的共培養(yǎng)物取出行掃描電鏡觀察(圖4),結(jié)果顯示純PLCL上面的干細(xì)胞形態(tài)聚縮,并未完全展開,表示純PLCL與細(xì)胞的親和力不佳。PLCL/ Poloxamer 85/15、90/10、95/5比例材料上的細(xì)胞形態(tài)學(xué)并無明顯區(qū)別,細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形或多邊形,表面光滑,形態(tài)完整,伸出較多足突與材料黏附緊密,細(xì)胞之間也已經(jīng)通過偽足聯(lián)系起來。

討 論

近年組織工程技術(shù)的進(jìn)步、組織工程皮膚的不斷完善,為大面積皮膚缺損和慢性創(chuàng)面修復(fù)提供了新的途徑,探索一種接近正常皮膚物理和生理特性的人工皮膚成為必要。PLCL是聚乳酸-聚己內(nèi)酯混合制成的有機(jī)高分子材料,大多數(shù)研究者認(rèn)為比值7∶3是較好的機(jī)械性能［8-9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PLCL的接觸角為131.5°±8.9°,親水性較差,故水等電解質(zhì)不易

透過。Polomaxer是聚氧丙烯與聚氧乙烯的共聚物,是一類新型的高分子離子表面活性劑,目前常用作藥

物的乳化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和吸收促進(jìn)劑等［10-11］,且來源廣泛、價(jià)格低廉、容易獲取,因此本實(shí)驗(yàn)擬采用高分子的Polomaxer與PLCL共紡納米支架。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PLCL/Polomaxer比例75/25支架出現(xiàn)較嚴(yán)重的纖維融合,因此75/25不宜作為本實(shí)驗(yàn)的組織工程支架材料。進(jìn)一步選取PLCL/Polomaxer比例95/5、90/10、85/15作為皮膚組織工程的支架材料。

理想的人工皮膚要求具有良好的生物組織相容性和表面活性,并且需要一定的可塑性、機(jī)械拉伸強(qiáng)度及抗磨損特性［12-13］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PLCL與Polomaxer共紡的納米材料纖維表面光滑,85/15、90/ 10及95/5比例的共紡支架纖維直徑分布均勻,且并未出現(xiàn)纖維融合的情況。材料的力學(xué)性能測(cè)定顯示靜電紡納米材料均具有較好的拉伸模量和拉伸強(qiáng)度,其中90/10及95/5比例的共紡支架拉伸強(qiáng)度最好,不易斷裂,與正常皮膚最為接近。水接觸角的測(cè)定提示Polomaxer的加入可明顯改善PLCL的親水性能,其中75/25、85/15、90/10比例共紡后水接觸角均為0°,而95/5的水接觸角為7.8°±2.7°,提示其親水性比其他3種稍差。CCK-8結(jié)果提示75/25、85/15、90/ 10及95/5比例的共紡支架上ADSCs的黏附增殖性能均明顯高于純PLCL組,但各比例共紡支架之間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上因素,90/10比例PLCL與Polomaxer共紡靜電紡納米材料可能更與皮膚的特性接近。該支架與ADSCs共培養(yǎng)3天后的掃描電鏡發(fā)現(xiàn)ADSCs形態(tài)完整、表面光滑、伸出較多足突與材料黏附緊密,而細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是反映細(xì)胞親和力的直接證據(jù)［14］。提示90∶10 PLCL/Polomaxer共紡靜電紡納米材料可以用作組織工程支架覆蓋創(chuàng)面,能促使種子細(xì)胞吸附,細(xì)胞因子和組織液容易透過支架,營(yíng)養(yǎng)種子細(xì)胞,從而可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

組織工程皮膚的目標(biāo)是應(yīng)用于臨床,促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)發(fā)揮屏障防護(hù)作用是其目標(biāo)。嚴(yán)重?zé)齻C(jī)械傷所致大面積皮膚組織缺損一直是創(chuàng)面愈合研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)難點(diǎn),新型的組織工程皮膚有望實(shí)現(xiàn)大面積創(chuàng)面治療領(lǐng)域的新突破。本實(shí)驗(yàn)研討不同比例PLCL/Polomaxer靜電紡納米材料作為組織工程皮膚的可行性研究,是新型的組織工程材料PLCL/ Polomaxer復(fù)合脂肪干細(xì)胞修復(fù)大面積皮膚創(chuàng)面研究的重要組成部分,兩者相容性的確立可為下一步的成表皮誘導(dǎo)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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The possibility of different proportions of electrospun nanomaterials p LCL/poloxamer as a skin tissue substitute

LIU Ning-hua1,MIAO Yue-e2,QI Fa-zhi1,GU Jian-ying1△
(1Department of Cosmetic and Reconstructive Surgery,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China；
2State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers-Department of Macromolecular Science, Fudan University,Shanghai 200433,China)

Objective To investigate the possibilities of different proportion of poly(ε-caprolactoneco-lactide)/Poloxamer(PLCL/Poloxamer)scaffolds work as a skin tissue engineering substitute.MethodsElectrospinning pure PLCL and PLCL/Poloxamer ratio of 75/25,85/15,90/10,95/5 nanofibers were prepared,and their surface morphology,mechanical and hydrophilic properties were measured.The adipose stem cells(ADSCs)were seeded on the scaffolds surface,and the scaffolds biologically activities with ADSCs were determined through water-soluble tetrazolium salt test(CCK-8)on day 1,3,7,10.Scanning electron microscopy was applied to observe the ADSCs morphology on day 3.ResultsThe nanofiber scaffoldsˊbreaking strength of 90/10 and 95/5 ratio was higher thanpure PLCL and 75/25,85/15 ratio(9.31±0.29,9.27±0.50,7.08±0.21,7.46±0.27,and 7.47± 0.21 MPa,respectively),and the water contact angle of 90/10,75/25,85/15 ratio was less than pure PLCL and 95/5 ratio(0°,0°,0°,131.5°±8.9°,and 7.8°±2.7°,respectively).On day 1,3,7,10,the adhesion and proliferation of ADSCs on PLCL/Poloxamer material was significantly higher than pure PLCL.Scanning electron microscopy showed that the 90/10 PLCL/Poloxamer scaffolds had a lot of ADSCs,the cells had complete cell morphology and smooth surface.Conclusions90/10 ratio of PLCL/Polomaxer had better mechanical properties and hydrophilicity than other groups,and the compatibility with ADSCs was better than pure PLCL.Therefore,90/10 ratio of PLCL/Polomaxer is more suitable tissue engineering material for skin tissue engineering.

adipose-derived stem cells； electrospinning； skin； PLCL/Poloxamer； scanning electron microscopy

R 628

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.006

2013-07-08；編輯：沈玲)

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃,2009CB930000)

△Corresponding author E-mail：gu.jianying@zs-hospital.sh.cn

*This work was supported by the National Key Basic Research program of China(2009CB930000)