鄭永鈿 繆英年 林澤宏

（中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

益氣化瘀湯對糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞纖維化的影響

鄭永鈿 繆英年 林澤宏

（中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400）

【摘要】目的觀察益氣化瘀湯對糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞纖維化的影響。方法將健康雄性SD大鼠50只，分為正常對照組、糖尿病組和益氣化瘀方高、中、低劑量組，每組均為10只，益氣化瘀方以稀釋成1∶2∶4不同濃度，高、中、低劑量組分別給予不同濃度的益氣化瘀方水煎劑[均按1.5 g/（kg·d）灌胃給藥]，正常對照組與糖尿病組模型組給予等量生理鹽水灌胃，共給藥12周，并益氣化瘀方對觀察糖尿病心肌病大鼠心肌組織光鏡灰度值及MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果益氣化瘀方可下調(diào) TGF-β1表達(dá)，升高 MMP-9/TIMP-1 比值。結(jié)論益氣化瘀方具有抑制糖尿病心肌纖維化的發(fā)生的作用，其機(jī)制可能是通過升高 MMP-9/TIMP-1 比值，下調(diào)TGF-β1表達(dá)，從而保持心肌間質(zhì)膠原合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡。

【關(guān)鍵詞】糖尿病心肌??；益氣化瘀湯

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者所特有的心臟病，是指糖尿病患者由于氧化應(yīng)激，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，心肌細(xì)胞不斷凋亡、喪失，并被膠原纖維代替，而幸存的心肌不能有效代償，使心肌細(xì)胞出現(xiàn)原發(fā)性損傷而引起廣泛的結(jié)構(gòu)異常，呈現(xiàn)出左心室肥厚、舒張期和（ 或） 收縮期心臟功能障礙的一種疾病狀態(tài)，最后導(dǎo)致心力衰竭的形成。這是糖尿病心肌病晚期心功能不全的重要原因[1]。益氣化瘀方為本院內(nèi)一科尊于經(jīng)典，并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)以及現(xiàn)代藥物研究成果所創(chuàng)立的藥方，組方藥物包括田七、丹參、仙鶴草、紅景天和五爪龍，全方共湊補(bǔ)虛益氣，益氣化瘀之效。在前階段的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀方具有凝、抗血栓、抗心律失常的作用，此外，還能通過調(diào)脂、抗腫瘤和雌激素作用來預(yù)防再狹窄時(shí)間的發(fā)生[2]。在進(jìn)一步的動(dòng)物模型研究中，我們發(fā)現(xiàn)益氣化瘀方亦有具有抑制糖尿病心肌纖維化的發(fā)生的作用，可預(yù)防糖尿病大鼠心肌纖維化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠 50只，體質(zhì)量（200±20）g，鼠齡 6～8 周，由中山市中醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ），購自美國 Sigma 公司；益氣化瘀方水煎劑（田七10 g、丹參20 g、仙鶴草15 g、紅景天10 g、五爪龍15 g，由中山市中醫(yī)院院內(nèi)制劑室制備，生藥含量：2.3 g/mL）。TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 單抗試劑盒，均購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組

選購50只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)取10只作為正常對照組，余40只分別一次性尾靜脈注射1%STZ溶液，劑量為45 mg/kg，并用0.5 mmol/L的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液（pH 4.5）試劑臨用前配制。正常對照組注射等量容積相同緩沖液。72 h后采尾靜脈血測血糖，＞16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠建模成功。將制備成功的40只大鼠隨機(jī)分為：糖尿病組和益氣化瘀方高、中、低劑量組，每組均為10只。

1.2.2 動(dòng)物給藥

將益氣化瘀方以稀釋成1∶2∶4不同濃度，高、中、低劑量組分別給予不同濃度的益氣化瘀方水煎劑[均按1.5 g/（kg·d）灌胃給藥]；正常對照組與糖尿病組模型組給予等量生理鹽水灌胃，共給藥12周。

1.2.3 指標(biāo)檢測

1.2.3.1 血糖監(jiān)測

采用德國拜耳拜安捷血糖檢測儀，于12周末采尾靜脈血測血糖，分別記錄5組大鼠血糖值。

1.2.3.2 心肌組織取材

12周末，用乙醚將大鼠麻醉后，采下眶后靜脈血后用2000 r/min離心10 min后，分離血清，留取標(biāo)本。打開胸腔后快速切除心臟，用4 ℃生理鹽水反復(fù)灌洗后，濾紙吸干，去除包膜。取部分心肌組織切成小塊，用2.5%戊二醛/0.1 mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH 7.4）固定，制成電鏡標(biāo)本，余心肌組織用10%中性福爾馬林液固定，用于制備光學(xué)顯微鏡標(biāo)本和免疫組化標(biāo)本。

1.2.3.3 心肌組織光鏡觀察

取5 mm3心肌組織，依次由低濃度到高濃度酒精進(jìn)行組織脫水，制備組織切片，脫蠟至水，分別行HE染色及VG膠原染色，封片后于光鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變，使用圖像分析儀測量心肌膠原容積百分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.2.3.4 心肌組織電鏡觀察

用 0.9%生理鹽水沖洗后切成1 mm3大小，溫箱干燥，先后于37 ℃過夜，45 ℃ 48 h，60 ℃ 24 h，取出后修塊，于超薄切片機(jī)上制備切片，厚度為50 nm，用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，每張切片分別于中部、右上、右下、左上及左下部隨機(jī)選取5個(gè)視野，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.2.3.5 TIMP-1、MMP-9、TGF-β1蛋白表達(dá)測定

采用免疫組化法，將石蠟切片放入恒溫水浴槽烤片2 h后浸入含0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）的高壓鍋內(nèi)，蓋上壓力閥至噴氣，持續(xù) 2～3 min 抗原修復(fù)，冷卻后用PBS（pH 7.2～7.6）洗滌。室溫20 min下滴加 5%BSA 封閉液，1∶100 稀釋TIMP-1、MMP-9、TGF-β1兔抗鼠單抗，4 ℃環(huán)境下過夜。PBS洗滌，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，室溫下20 min，PBS洗滌3 次，2分/次。滴加SP復(fù)合物，室溫下20 min，PBS洗滌4 次，2分/次。DAB顯色后用蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，逐級使用酒精脫水至透明后封片。每張切片于中部、右上、右下、左上及左下部隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×400）光鏡下觀察攝片，測量灰度值，以平均灰度值作為該切片的灰度值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布者，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié) 果

表1 各組心肌心肌纖維化測定結(jié)果比較（n=10）

表2 MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)的測定結(jié)果

2.1 心肌間質(zhì)膠原容積百分?jǐn)?shù)（ICVF）測定結(jié)果

模型組。經(jīng)益氣化瘀方干預(yù)，高劑量益氣化瘀方組（表1）。

2.2 益氣化瘀方對MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

TGF-β1升高、MMP-9/TIMP-1 比值下降可能是糖尿病心肌纖維化發(fā)生的機(jī)制之一。結(jié)果表明，益氣化瘀方可能是通過升高 MMP-9/ TIMP-1 比值，下調(diào) TGF-β1表達(dá)，保持心肌間質(zhì)膠原合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，達(dá)到抑制糖尿病心肌纖維化的作用（表2）。

3 討 論

糖尿病心肌病目前尚缺乏有效的特異性治療，臨床多以綜合控制多種危險(xiǎn)因素，改善心力衰竭癥狀為主?，F(xiàn)在對于糖尿病心肌病的治療主要依賴于西藥，包括鈣拮抗劑、ACEI、ARB、噻唑烷二酮衍生物及他汀類等藥物。此類藥物具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3]，具有心血管保護(hù)作用。但其不足之處為：作用靶點(diǎn)單一，無法兼顧多系統(tǒng)、多因素的影響，療效欠佳，副作用較大。中藥作為我國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，在糖尿病心肌纖維化的醫(yī)治中尚未發(fā)揮其獨(dú)特的療效，因此為發(fā)展祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥，有效利用我國所特有的醫(yī)療資源，促進(jìn)我國的醫(yī)藥文化和人民健康水平，深入進(jìn)行中藥的防治研究有著十分重要的臨床意義，社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

目前對于糖尿病心肌病的藥物篩選研究主要以益氣化瘀為主，如于斌[4]等以血府逐瘀湯探討對大鼠糖尿病性心肌病的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯能夠顯著降低大鼠血糖、血脂，減輕結(jié)構(gòu)破壞，抑制纖維化的程度，延緩心肌病進(jìn)程，起到改善心肌病的作用。齊鋒[5]等研究發(fā)現(xiàn)生脈解毒通絡(luò)膠囊與依那普利相比較，雖在降低AngⅡ、減少M(fèi)CP-1的活化及表達(dá)的作用略弱，但在血糖控制上效果較好，二者在控制心臟間質(zhì)ColⅠ、Colm的降解方面作用相似。本實(shí)驗(yàn)用益氣化瘀方對糖尿病大鼠心肌纖維化模型進(jìn)行干預(yù)，觀察心肌病理形態(tài)學(xué)改變及心肌膠原代謝情況，比較其TGF-β1、MMP-9、TIMP-1表達(dá)影響，從分子生物學(xué)水平探討益氣化瘀方在糖尿病心肌病心肌纖維化中的作用及可能機(jī)制，以期為糖尿病心血管并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Fang ZY,Prines JB,Marwick TH.Diabetic cardiomy-opathy:Evidence,mechanisms,and the rapeutic impli-cations[J].Endocr,2004, 25(4):543-567.

[2] 安輝, 繆燦銘, 李雪山.益氣化瘀方對60例冠狀動(dòng)脈介入治療后再狹窄的預(yù)防作用[M].中醫(yī)研究,2009,22(6):26-27.

[3] Wei W,Liu QJ,Tan Y,et al.Oxidative stress,Diabetes,and Diabetic Complications[J].Hemoglobin,2009,33(5):370-377.

[4] 于斌,趙安斌.血府逐瘀湯對大鼠糖尿病性心肌病的影響[J].中國病理生理雜志,2010,26(11):2136-2141.

[5] 齊鋒,鄧悅.生脈解毒通絡(luò)膠囊干預(yù)糖尿病大鼠心肌纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].吉林中醫(yī)藥,2009,29(3):259-261.

中圖分類號：R587.2；R542.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-8194（2014）15-0067-02