劉明菲，燕 平，喬瑞瑞，金曉飛，王海軍，閆麗萍

(山西中醫(yī)學院，山西太原 030024)

當今社會在“快餐式”的飛速發(fā)展中，競爭壓力越來越大，抑郁癥的發(fā)病率呈上升趨勢，抑郁癥以興致低落和自我體驗為核心癥狀［1］。目前抑郁癥機制尚不明確，眾說紛紜，廣為大家所探討的機制其一是下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA軸)［2～4］功能失調的研究，其二是有關細胞外信號通路系統(tǒng)(ERK通路)功能失調的探討［5］。結合之前所研究的針灸治療抑郁癥最佳組方，本文旨以此為基礎，針對以上兩個機制研究，討論針灸治療抑郁癥最佳組方對慢性應激抑郁型大鼠的治療機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠30只，體重(250±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

ERK1免疫組化試劑盒購自山西吉泰和寧科技有限公司。FA-1004型精密電子天平，上海天平儀器廠。

2 實驗方法

2.1 分組

將30只大鼠隨機分為3組。分別為空白組(n=10)，模型組(n=10)和針刺治療“解郁方”組(百會+神門+太沖)。

2.2 模型制備

采用李藝等［6］、王雀良等［7］實驗造模方法并加以改良。本實驗采用21 d不同刺激。應激源包括:冷水游泳(4 ℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、晝夜顛倒(24 h)、熱烘(45℃，5 min)、束縛 (3 h)，夾尾(3 min)。以7 d為1個周期，每天隨機安排其中1種，單籠飼養(yǎng)。

2.3 針刺處理

造模開始后就對針刺治療組進行治療。選用華佗牌15 mm針灸針進行針刺，連接到SDZⅡ型HANS電刺激儀。電針頻率為2 Hz，刺激強度不超過2 mA［8］，共電針20 min。每日1次，于應激造模前1 h針刺，連續(xù)治療3周。模型組抓取、固定，但不做針刺，其他處理同針刺組?？瞻捉M群養(yǎng)不予任何處理。

2.4 觀察指標

2.4.1 腎上腺指數 大鼠按劑量10 g/L腹腔注射20%的烏拉坦，麻醉后斷頭，手術剪解剖腹腔，完整取出腎上腺，用眼科鑷剔除結締組織和脂肪，用1 mL注射器抽取9%氯化鈉注射液1 mL，將腎上腺殘留的血水沖凈，用定性濾紙將其吸干后，稱取腎上腺質量，計算腎上腺指數。計算公式為:腺體指數=腺體質量(mg)/體重(100g)。

2.4.2 ERK1免疫組化陽性細胞計數 方法同上，斷頭后，為方便解剖，冰上頭顱，迅速游離左側完整海馬組織，取出左側海馬組織，標本經10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片以海馬為中心做冠狀面切片，厚度50 μm。免疫組化SABC法染色。

2.4.3 SABC法染色 將切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中烤1 h;切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，10 min/次;切片經下行酒精水化，無水乙醇5 min，95% 乙醇 2 次(2 min/次)，85% 乙醇2 min，75%乙醇2 min，自來水沖洗 3次，雙氧水洗 2次(2 min/次);水浴鍋加熱切片至100℃，室溫自然冷卻，自來水沖洗，雙氧水及 TBS分別洗滌 2次(2 min/次);滴加封閉緩沖液，ERK1一抗孵育切片，TBS洗滌，滴加封閉緩沖液，37℃濕盒孵育10 min;30 min濕盒孵育生物素化羊抗兔IgG(1∶400);TBS洗滌，Tween 20封閉20 min，室溫下孵育HRP-SA復合物(1∶150)，TBS洗滌5 min，2次，DAB 顯色液加強染色;脫水、透明、封片，陰性對照用PBS替代一抗。光鏡下觀察并照相。

2.5 結果判定

ERK1陽性定位于細胞質，利用Image Pro Plus6.0多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)，每張切片(200倍光鏡下)選擇4個不重疊的視野，圖像分析軟件進行圖像采集和處理，選取海馬兩側齒狀回部位，ERK1陽性染色定位于細胞胞漿，用單位面積陽性細胞記數和總細胞數的百分比表示該成分的相對含量，取其平均值。

3 統(tǒng)計學方法

實驗后的統(tǒng)計數據應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學處理，以均數±標準差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 腎上腺指數

對抑郁模型大鼠腺體重量的影響，與空白組大鼠相比，均出現了顯著性變化(P＜0.05)，模型組及治療組均出現腎上腺指數升高。與模型組相比，治療組與其存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。結果提示針刺“解郁方”治療組對抑郁模型所致腎上腺指數的上升具有一定的抑制作用(見表1)。

4.2 ERK1陽性細胞相對含量

空白組的ERK1陽性神經元數目的相對含量較治療組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，較模型組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。模型組的ERK1陽性神經元數目的相對含量較治療組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)?？瞻讓φ諡殛幮苑磻?。結果提示抑郁癥能抑制ERK通路調節(jié)，針刺治療抑郁癥能有效興奮其通路恢復正常(見表2)。光鏡下可見ERK1免疫組織化學的陽性細胞位于海馬區(qū)，主要集中于CA1、CA3區(qū)錐體細胞，其陽性反應存在于細胞胞漿中，細胞胞核不染色(見圖1)。

表1 針刺對各組大鼠腺體質量的影響Table 1 Effect of the Rats＇Adrenal Mass in Acupuncture Groups

表2 各組大鼠海馬ERK1相對含量比較 個/HPTable 2 Comparison of Relative Contents of Erk1 in Each Groups one/HP

圖1 各組海馬齒狀回ERK1的表達，免疫組化SABC法Fig 1 Expression of Hippocampal Pentate Gyrus ERK1and Immunolistochemical SABC Method

5 討論

抑郁癥的生理病理機制十分復雜。目前認為，抑郁癥是由多種因素相互作用的結果，本文就該問題進行實驗以探尋針刺治療抑郁癥機制，通過腺體質量研究其與下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸的關聯，通過海馬組織ERK1的陽性細胞相對含量發(fā)現針刺治療抑郁癥與ERK通路關系。

Amsterdam等［9］文獻研究表明，與非抑郁人群相比，抑郁癥患者的腎上腺形態(tài)增大;HPA軸功能活躍，內源性ACTH的慢性刺激導致腎上腺肥大。本文結果提示抑郁型大鼠腎上腺增重、肥大，雖尚不能達到正常大鼠水平，但模型組大鼠腎上腺質量有所改觀。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分之一，參與情緒、記憶和學習、免疫、行為等的調節(jié)，它的損傷在各種應激所致疾患中起至關重要的作用。因此，在抑郁癥的機制研究中，探討應激對海馬的影響是極為重要的。應激能破壞神經元損傷與再生之間的平衡，顆粒細胞減少，CA3錐形神經元萎縮及數目的減少，海馬體積下降，功能受損，最終出現抑郁癥的臨床變現。ERK是一個重要的細胞內信號分子，調控基因表達。ERK1可誘發(fā)腦內神經元的快速變化，慢性應激可以一定程度上引起大鼠腦內ERK通路表達抑制，而電針可以改善其抑制作用。電針可活化ERK通路上的關鍵指標ERK，故而對下游產生影響而發(fā)揮抗凋亡和抗抑郁的作用。本文研究ERK蛋白相對含量提示，電針能有效改善神經元凋亡、萎縮等現象，其效果基本達到正常大鼠水平，因此針刺能有效改善其功能，更對ERK通路有活躍功能。

［1］ 龔紹麟.抑郁癥［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.

［2］ 徐 虹，孫忠人，李麗萍，等.針刺治療抑郁癥及其對患者下丘腦－ 垂體 －腎上腺軸的影響［J］.中國針灸，2004，24(2):78-79.

［3］ 杜元灝，李桂平，顏 紅，等.調神疏肝針法治療抑郁的臨床研究［J］.中國針灸，2005，25(3):151.

［4］ 孫冬瑋，王 瓏.針刺對慢性應激抑郁模型大鼠HPA軸的影響［J］.上海針灸雜志，2007，26(2):32.

［5］ 盧 峻，時宇靜，費宇彤，等.電針對抑郁模型大鼠腦磷酸化cAMP反應元件結合蛋白表達的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，12(5):380-382.

［6］ 李 藝，具紫勇，夏 勇，等.電針對圍絕經期抑郁癥模型大鼠的效應研究［J］.上海針灸雜志，2010，29(10):670-673.

［7］ 王雀良，潘集陽，劉亞平，等.抑郁癥動物模型的回顧與展望［J］.廣東醫(yī)學，2011，32(7):932-935.

［8］ 陳華德，金靈青，婁 冉，等.百會穴電針和埋線對慢性應激抑郁模型大鼠行為學及血清CORT和ACTH的影響［J］.上海針灸雜志，2010，29(4):244-247.

［9］ Willner P.Relidity and Utility of the Chronic Mild Stress Model of Depression:a 10-year Review and Evaluation［J］.Psychophamacology(berl)，1997，134(4):319.