孫穎穎，沈 橋，黃曉斌，董曉柯，李光成，王長海

（1.淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

0 引言

研究表明，海藻體內(nèi)的某些次生代謝物是抑制微藻生長的主要原因［1－2］，已經(jīng)鑒定出某些海藻體內(nèi)的抑藻物質(zhì)，例如墨角藻中的聚酚［3］、海頭紅體內(nèi)的單萜［4］、川蔓體內(nèi)的二萜［5］、小珊瑚藻中的溴仿［6］和孔石莼體內(nèi)的不飽和脂肪酸［7］等，能顯著抑制微藻的生長。海藻通過滲濾、揮發(fā)和分泌等多種方式將生物堿、酚酸、脂肪酸、硫化物、糖苷、萜類、內(nèi)酯、鞣酸、有機酸和糖類等物質(zhì)釋放到環(huán)境中［3－7］。

前期研究表明，滸苔（Enteromorphaprolifera）和江蘺（Gracilarialemaneiformis）中含有能明顯抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻等赤潮微藻生長的物質(zhì)［8－9］，并采用甲醇浸泡制備到具有明顯抑藻活性的提取物［10－11］。然而，由于采用甲醇和丙酮浸泡制備的海藻提取物含有較高含量的色素，在祛除色素過程中致使活性組分損失較多。因此，本文采用乙醚浸泡滸苔和江蘺粉末，經(jīng)過濾、濃縮和液液萃取分離，制備到海藻分離組分。在此基礎(chǔ)上，利用化合物鑒定試驗（主要是生物堿、酚酸和內(nèi)酯、香豆素檢測）對這些海藻組分進行定性，并采用抑藻活性檢測方法，確定活性組分。更進一步，采用硅膠GF254薄層層析檢測，確定上述活性組分的適宜展開劑，為后續(xù)分離純化2種海藻的抑藻活性物質(zhì)奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

中肋骨條藻無菌株由中國海洋大學(xué)提供，經(jīng)進一步分離純化后由淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室保存，在f／2培養(yǎng)基［14］中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（20±0.1）℃，光照強度40μmol／（m2·s1），光暗比12∶12。

滸苔采集于青島太平角，江蘺來自福建沿海，由蘇州大學(xué)沈頌東教授提供。經(jīng)適當(dāng)處理后，2種海藻于40℃下烘干，粉碎至0.3mm備用。

天然海水經(jīng)過脫脂棉和300目篩絹過濾，煮沸、冷卻，pH和鹽度分別調(diào)節(jié)至8.5和30備用（實驗所用海水均作如上處理）。

1.2 2種海藻提取物的制備及其液液萃取分離

500g海藻干粉末，置于錐形瓶內(nèi)，加入1 000 mL乙醚，室溫下浸泡提取24h。采用虹吸法，將乙醚浸提液取出，剩余部分經(jīng)2 500g下離心10min，濾紙過濾。上述干粉末再次加入乙醚，反復(fù)浸泡提取，直至干粉末變?yōu)榘咨?。合并上述所有浸提液?0℃下減壓蒸干，制備到海藻提取物。提取物加入乙醚溶解后，用0.5mol／L NaHCO3溶液萃取3次。下層減壓蒸干，制備到組分A。上層加入0.1mol／L NaOH溶液萃取3次，下層減壓蒸干，制備到組分B。上層待乙醚揮發(fā)完畢后，加入0.1mol／L NaOH溶液，充分振蕩后，加入乙醚進行萃取，所獲乙醚層減壓蒸干，制備到組分C。下層加入0.1mol／L HCl溶液中和pH至中性后，加入乙醚萃取，乙醚層減壓蒸干，制備到組分D。稱量質(zhì)量后，上述4種提取物用無水乙醇定容，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 化合物定性檢測

1.3.1 酚酸鑒定試驗 1mL提取物乙醇溶液加入到質(zhì)量分數(shù)為1%～5%的三氯化鐵溶液中，觀察顏色，呈現(xiàn)藍、暗綠或藍紫色為酚酸類物質(zhì)的陽性反應(yīng)。

提取物乙醇溶液點樣于硅膠G板上，氯仿∶丙酮∶甲酸為展開劑，三氯化鐵溶液為顯色劑，出現(xiàn)墨綠色斑點，表明存在酚酸類物質(zhì)。

1.3.2 香豆素、內(nèi)酯鑒定試驗 加入質(zhì)量分數(shù)為1%的氫氧化鈉溶液1mL到1mL提取物乙醇溶液中，沸水浴3～4min，溶液比未加熱時澄清。加入質(zhì)量分數(shù)為2%的鹽酸溶液1mL酸化，靜置，溶液變渾濁，表明存在香豆素、內(nèi)酯類物質(zhì)。

提取物乙醇溶液點樣于硅膠G板上，石油醚∶乙酸乙酯為展開劑，254nm下呈現(xiàn)藍色熒光，表明存在香豆素、內(nèi)酯類物質(zhì)。

1.3.3 生物堿鑒定試驗 1mL提取物乙醇溶液加入到碘化汞鉀試劑中，充分混勻后，靜置，出現(xiàn)白色或淺黃色沉淀為陽性反應(yīng)。

提取物乙醇溶液點樣于硅膠G板上，氯仿∶甲醇為展開劑，碘化鉍鉀為顯色劑，出現(xiàn)橘紅色斑點，表明含有生物堿類物質(zhì)。

1.3.4 黃酮鑒定試驗 加入適量濃氨水到1mL提取物乙醇溶液中，出現(xiàn)亮黃或橙色顏色反應(yīng)為陽性反應(yīng)。

提取物乙醇溶液點樣于硅膠G板上，254nm下呈現(xiàn)亮黃或黃綠色熒光，表明存在黃酮類物質(zhì)。

1.4 抑藻活性檢測

在f／2培養(yǎng)基中，添加實驗“1.2”制備的8種組分。隨后，接種中肋骨條藻，接種細胞數(shù)量均為25×104mL－1，8種組分終質(zhì)量濃度為1.40g／L，同時設(shè)定添加相同體積無水甲醇的對照組，每個處理3個重復(fù)。所有培養(yǎng)瓶置于GXZ－260B智能型光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，溫度（26±1）℃，光照強度40μmol·（m2·s）－1，光暗比為12∶12。每天定時搖動培養(yǎng)瓶3次，以防止微藻附壁生長。每隔1d從培養(yǎng)瓶中取1mL培養(yǎng)液，用Lugol’s試劑固定后，計數(shù)藻細胞數(shù)量的變化。取樣后向培養(yǎng)瓶中加入1mL濃縮f／2培養(yǎng)液，以維持培養(yǎng)液體積恒定。

1.5 硅膠GF254薄層層析檢測

點樣粗提物的乙醇溶液于硅膠GF254上，以氯仿∶甲醇（16∶1）、氯仿∶甲醇（8∶1）、氯仿∶丙酮∶甲酸（15∶3∶2）和石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，254 nm下觀察各分離組分的展開情況，以確定上述組分后續(xù)分離純化的適宜展開劑。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進行獨立樣本檢驗統(tǒng)計分析，p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著性差異。

微藻生長抑制率I＝（1－N／N0）×100%，式中，N為處理組藻細胞數(shù)量（104mL－1）；N0為對照組藻細胞數(shù)量（104mL－1）。

2 結(jié)果和分析

2.1 2種海藻提取物的制備及其液液萃取分離

分別以500g滸苔干粉末和500g江蘺干粉末為原料，制備到2.753g墨綠色滸苔提取物和5.628 g暗棕色江蘺提取物。上述2種提取物經(jīng)液液萃取分離后，分別制備到4種分離組分，質(zhì)量和得率（質(zhì)量分數(shù)）如表1所示。

表1 2種海藻提取物的液液萃取分離Table 1 Liquid－liquid extraction of two kinds of extracts from two macroalgae

2.2 2種海藻分離組分的化合物鑒定試驗

上述8種組分用無水甲醇定容，使其終質(zhì)量濃度均為40g／L。取適量溶液進行生物堿、酚酸和內(nèi)酯、香豆素檢測，結(jié)果如表2所示。

表2 2種海藻分離組分的化合物鑒定試驗結(jié)果Table 2 Compound identification test of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction

由表2可以看出，滸苔分離組分A含有酚酸，組分B含有內(nèi)酯、香豆素，組分C含有生物堿，組分D并未檢測出生物堿、酚酸和內(nèi)酯、香豆素等物質(zhì)；江蘺分離組分A和組分B含有內(nèi)酯、香豆素，組分C含有生物堿、酚酸和內(nèi)酯、香豆素，組分D同樣未檢測出生物堿、酚酸和內(nèi)酯、香豆素等物質(zhì)。

2.3 2種海藻分離組分的抑藻活性

圖1表明，滸苔4種分離組分中，組分A、組分C和組分D對中肋骨條藻表現(xiàn)出明顯的（p＜0.05）抑制作用。第8d，對中肋骨條藻的生長抑制率超過58%。其中，組分A致使中肋骨條藻細胞接近死亡（第6d）。組分B則明顯（p＜0.05）促進了中肋骨條藻的生長。從第4d開始，使得添加組分B的實驗組藻細胞數(shù)量為對照組藻細胞數(shù)量的2.0倍，并且，這種促進生長現(xiàn)象一直持續(xù)到實驗結(jié)束。

江蘺4種分離組分中，組分B、組分C和組分D對中肋骨條藻表現(xiàn)出明顯的（p＜0.05）抑制作用。第6d，對中肋骨條藻的生長抑制率在71%以上。在實驗設(shè)定的質(zhì)量濃度下，組分A未對中肋骨條藻的生長產(chǎn)生明顯（p＞0.05）影響（圖1）。

圖1 2種海藻分離組分對中肋骨條藻生長的影響Fig.1 Effect of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction on the growth of Skeletonema costatum

2.4 2種海藻分離組分的硅膠GF254薄層層析分離

在上述實驗基礎(chǔ)上，選定滸苔分離組分A、組分B和組分C以及江蘺分離組分B和組分C，采用硅膠GF254薄層層析進行檢測，以確定后續(xù)分離純化的適宜展開劑。表3列出了2種海藻分離組分的硅膠GF254薄層層析分離結(jié)果。

表3 2種海藻分離組分的硅膠GF254薄層層析分離Table 3 Silica gel GF254thin－layer chromatography of fractions of two kinds of extracts from two macroalgae by liquid－liquid extraction

在表3中，滸苔分離組分A展開劑為氯仿∶丙酮∶甲酸（16∶2∶2），出現(xiàn)5個比較明顯的斑點。滸苔分離組分B和江蘺分離組分B展開劑為石油醚∶乙酸乙酯（1∶1）和石油醚∶乙酸乙酯（1∶8），依次出現(xiàn)4個斑點和5個斑點。滸苔分離組分C以氯仿∶甲醇（8∶1）為展開劑，出現(xiàn)6個斑點。江蘺分離組分C在氯仿∶甲醇（16∶1）展開，出現(xiàn)6個斑點；在氯仿∶丙酮∶甲酸（16∶2∶2）展開下，出現(xiàn)4個斑點；以石油醚∶乙酸乙酯（1∶2）為展開劑時，出現(xiàn)3個斑點。上述5種組分經(jīng)選定的展開劑展開后，在254nm下檢測，發(fā)現(xiàn)所出現(xiàn)斑點比較分散，展開效果較好，利于后續(xù)的分離純化。本文中，由于2種海藻的分離組分D的化合物定性檢測結(jié)果未知，因此，目前尚未進行硅膠GF254薄層層析檢測。

3 討論

目前，已經(jīng)證實海藻分泌的萜類［4－5］、不飽和脂肪酸類［7］和酚酸類［12－16］物質(zhì)具有明顯的抑藻活性。本文通過調(diào)節(jié)不同的酸堿性改變物質(zhì)的解離狀態(tài)，進而實現(xiàn)滸苔和江蘺乙醚提取物的初步分離，依次使浸提液弱堿化、強堿化、再酸化，制備到含有不同物質(zhì)的組分（表1和表2）。同時，抑藻活性檢測表明，滸苔分離組分A、組分C、組分D和江蘺分離組分B、組分C、組分D均顯著抑制了中肋骨條藻的生長（圖1）。表2中，滸苔分離組分A和江蘺分離組分C均含有酚酸類物質(zhì)。這表明此2種海藻中的酚酸類物質(zhì)很可能是具有抑藻活性的物質(zhì)。滸苔分離組分C中存在生物堿類物質(zhì)，江蘺分離組分B中含有內(nèi)酯、香豆素類物質(zhì)，而此2種組分同樣明顯抑制了中肋骨條藻的生長，表明生物堿和內(nèi)酯、香豆素很可能也具有抑藻活性。滸苔分離組分D和江蘺分離組分D中均未檢測出酚酸、生物堿和內(nèi)酯、香豆素等物質(zhì)，因此，其抑藻成分還有待進一步研究。

此外，值得注意的是，滸苔分離組分B明顯促進了中肋骨條藻的生長（圖1），而檢測發(fā)現(xiàn)組分B中含有內(nèi)酯、香豆素（表2）。結(jié)果表明，此組分中很可能具有促進生長的物質(zhì)，或抑藻活性物質(zhì)濃度較低，在低濃度時對中肋骨條藻的生長表現(xiàn)出了促進作用，具體原因還需要進一步研究。更進一步，采用硅膠GF254薄層層析對滸苔分離組分A、組分B和組分C以及江蘺分離組分B和組分C進行檢測，確定了此5種組分后續(xù)分離純化的適宜展開劑，為后續(xù)研究滸苔和江蘺抑藻活性物質(zhì)的分離純化奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。

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