龔曉明,鄭 瀾,瞿樹(shù)林,雷志軍,凡 婷,陳伊琳

(1.四川理工學(xué)院體育學(xué)院,四川 自貢 643000;2.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410012)

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)中老年大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的影響

龔曉明1,2,鄭 瀾2,瞿樹(shù)林2,雷志軍2,凡 婷2,陳伊琳2

(1.四川理工學(xué)院體育學(xué)院,四川 自貢 643000;2.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410012)

目的:探討有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)中老年大鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的影響。方法:健康中年雄性SD大鼠12只,按體重隨機(jī)分為兩組,即空白對(duì)照組和有氧運(yùn)動(dòng)組。采用乳酸閾測(cè)定法和遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練建立有氧運(yùn)動(dòng)模型,每周訓(xùn)練6天,為期16周。方案結(jié)束后12h提取大鼠骨髓,運(yùn)用密度梯度離心法分離得到單個(gè)核細(xì)胞,以EGM-2培養(yǎng)誘導(dǎo)其分化獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞,通過(guò)雙熒光染色法觀察細(xì)胞對(duì)乙?；兔芏戎鞍椎臄z取和與荊豆凝集素1的結(jié)合,并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞。倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)量和計(jì)算集落形成率以反映細(xì)胞增殖情況。結(jié)果:各組貼壁細(xì)胞數(shù)量第7d多于第48h(P＜0.01);與對(duì)照組相比,有氧運(yùn)動(dòng)組貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P＜0.01),且集落形成率大(P＜0.01)。結(jié)論:有氧運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)中老年大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖。

有氧運(yùn)動(dòng);內(nèi)皮祖細(xì)胞;骨髓;細(xì)胞培養(yǎng);增殖

眾所周知,心血管疾病是老年人群中的常見(jiàn)病,研究表明,增齡能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能損害,從而使外周動(dòng)脈和小阻力動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性血管舒張受損,彈性降低,進(jìn)而引發(fā)高血壓、冠心病等心血管疾病[1-2]。研究證實(shí),體育鍛煉尤其是有氧運(yùn)動(dòng)能改善老年人的血液循環(huán)和心、腦血管功能[3-5],但機(jī)制不明確。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一種能自我更新、增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的干細(xì)胞,在某些生理、病理狀態(tài)下,EPCs可通過(guò)骨髓釋放入血,黏附于血管內(nèi)皮,不斷增殖、分化形成單層內(nèi)皮結(jié)構(gòu),參與微血管再生和內(nèi)皮修復(fù)[6],而血管結(jié)構(gòu)和功能損害的早期標(biāo)志便是內(nèi)皮功能障礙[7]。有實(shí)驗(yàn)表明,體育鍛煉可以增加冠心病患者和有心血管病危險(xiǎn)因素者的EPCs數(shù)量[8],還可增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量、增強(qiáng)內(nèi)皮功能,從而避免血管疾病發(fā)生[9]。

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)能使青年大鼠心肌血管壁上的AC133(又稱CD133)蛋白表達(dá)增多[10-11](AC133是早期EPCs的特異性表面標(biāo)記物),后又通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)的大鼠心肌組織微血管壁上有EPCs存在[12],且大量增殖[13]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)有氧運(yùn)動(dòng)后老年大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞,探討有氧運(yùn)動(dòng)是否能影響其增殖能力,從而改善血管內(nèi)皮修復(fù)和血管再生能力,為體育鍛煉對(duì)老年人心腦血管影響的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康雄性14月齡Sprague-Dawley大鼠12只,體重為460.5±59.26g(由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)。用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng),生活期間室溫保持20℃-23℃,相對(duì)濕度45-55%,每天光照12h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按體重隨機(jī)各分為兩組,即空白對(duì)照組和有氧運(yùn)動(dòng)組。

1.2 儀器與試劑

相差倒置顯微鏡(Olympus,日本),熒光顯微鏡(Nikon,日本),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(杭州立泰科技有限公司),大鼠淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所),EGM-2完全培養(yǎng)基(Clonetics,Lonza, USA),Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL,Invitrogen,USA),FITC標(biāo)記的荊豆凝集素1 (FITC-UEA-1,簡(jiǎn)稱lectin,Sigma,USA)。

1.3 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排

運(yùn)用雷志軍報(bào)道的乳酸閾測(cè)定法監(jiān)控有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[14],確定遞增負(fù)荷式訓(xùn)練的有氧運(yùn)動(dòng)方案(表1),每天跑臺(tái)訓(xùn)練1次,每周6天,共16周。

表1 大鼠訓(xùn)練方案(速度×持續(xù)時(shí)間)

1.4 EPCs分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

訓(xùn)練方案結(jié)束后12h,稱量體重并記錄后,用0.4%水合氯醛lmL/100g體重麻醉,70%的酒精中浸泡1min(除頭部),將大鼠呈仰臥位固定于木板上,置超凈工作臺(tái)內(nèi),暴露其胸腔,用注射器自心尖快速抽血至無(wú)血液抽出,剪開(kāi)兩后肢皮毛,取下股骨和脛骨,用5mL注射器吸PBS液反復(fù)沖洗其骨髓腔收集骨髓沖洗液。將骨髓腔沖洗液加入含有大鼠淋巴細(xì)胞分離液的離心管(按比例1:1),22℃下2000rpm離心20min,用吸管收集中間白膜層的單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclear cells,MNCs),0.01mol/L PBS液洗滌2次,依次以2000rpm及1500rpm室溫離心10min。用EGM-2完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至3×106/cm2接種于培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)液,去除未貼壁細(xì)胞,之后每3d換液一次,應(yīng)用相差倒置顯微鏡連續(xù)觀察體外培養(yǎng)EPCs的形態(tài)及增殖情況。

1.5 EPCs的雙熒光染色鑒定

采用前期報(bào)道的方法進(jìn)行EPCs的雙熒光染色鑒定[15]。

1.6 EPCs增殖能力檢測(cè)

貼壁細(xì)胞計(jì)數(shù):細(xì)胞培養(yǎng)48h后換液,每個(gè)樣本隨機(jī)取5個(gè)視野,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目(20 ×10),繪制柱狀圖;細(xì)胞培養(yǎng)至第7d,按上述方法倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞數(shù)目(20×10),繪制柱狀圖。

集落形成率(集落數(shù)目):培養(yǎng)至第10d,每個(gè)樣本各取3盤(pán)計(jì)數(shù)細(xì)胞集落數(shù),每集落至少含50個(gè)細(xì)胞,求平均值(n=6)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析,顯著性差異水平α=0.05,P＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光染色鑒定結(jié)果

貼壁細(xì)胞被Dil-ac-LDL染色后發(fā)紅色熒光,與FITC-UEA-1結(jié)合發(fā)綠色熒光,而發(fā)黃色熒光的細(xì)胞為雙熒光染色陽(yáng)性,可鑒定為正在分化的EPCs(圖1)。

圖1 EPCs的熒光染色鑒定(×100)

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

骨髓分離后獲得的MNCs培養(yǎng)48h后半量換液,見(jiàn)大部分細(xì)胞已貼壁,其中少量呈梭形,表明細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入貼壁生長(zhǎng)階段。第5-7d,貼壁細(xì)胞集落開(kāi)始形成,即集落生成單位(colony-forming unit,CFU),數(shù)量較少、大小不一,表明此時(shí)細(xì)胞的增殖開(kāi)始活躍[16]。第10d細(xì)胞集落明顯增多,彼此相連并聚集于培養(yǎng)瓶中間區(qū)域生長(zhǎng)(圖2)。第12d觀察細(xì)胞集落與第10d在集落細(xì)胞形態(tài)及貼壁梭形細(xì)胞密度上大致相似,表明此階段細(xì)胞增殖緩慢,進(jìn)入平臺(tái)期。倒置顯微鏡下,兩組細(xì)胞在各階段的形態(tài)沒(méi)有明顯差異。

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h、第7d和第10d的形態(tài)(×100)

2.3 EPCs增殖能力檢測(cè)結(jié)果

培養(yǎng)48h和第7d,有氧運(yùn)動(dòng)組貼壁細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組都增加(P＜0.01),各組細(xì)胞在7d內(nèi)都有增殖(P＜0.01)(圖3)。培養(yǎng)至第10d,有氧運(yùn)動(dòng)組貼壁細(xì)胞集落形成率為8.33±1.42,比對(duì)照組的5.69±0.91高(P＜0.01)。

圖3 48h和第7d細(xì)胞貼壁數(shù)目

3 分析與討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,骨髓來(lái)源的EPCs能夠遷移到血管形成活躍的組織,參與病理和生理性血管形成[17],而人體實(shí)驗(yàn)也證實(shí),骨髓來(lái)源的EPCs在缺血組織中起到了促進(jìn)新血管生成作用[18]。研究也顯示,年齡增長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致骨髓EPCs數(shù)量減少,增殖、遷移和粘附能力下降,從而降低修復(fù)內(nèi)皮的功能,而通過(guò)骨髓EPCs移植可幫助損傷的內(nèi)皮修復(fù)[19-20]。本研究通過(guò)對(duì)中年大鼠進(jìn)行16周的有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,中年大鼠已進(jìn)入老年期[21],但骨髓的EPCs仍能在體外培養(yǎng)7d內(nèi)持續(xù)增殖,而有氧運(yùn)動(dòng)不僅促進(jìn)這種增殖,而且能使細(xì)胞形成更多的集落,表明這種運(yùn)動(dòng)很可能促進(jìn)衰老機(jī)體的血管內(nèi)皮修復(fù),有待對(duì)細(xì)胞黏附能力等情況進(jìn)行檢測(cè)后確認(rèn)這一結(jié)果。這一結(jié)論跟前期發(fā)現(xiàn)的外周血EPCs增殖情況類似[15],如果外周血中增殖的EPCs僅僅是早期EPCs,那么骨髓中的EPCs增殖又有何意義?骨髓中的EPCs主要是晚期EPCs,這種EPCs只少量存在于外周血中,易在人臍靜脈內(nèi)形成單層ECs[5],因此,它的主要功能應(yīng)當(dāng)是修復(fù)內(nèi)皮,雖不直接參與血管再生,但具有促進(jìn)和協(xié)助作用。此外,某些干細(xì)胞在一定條件下可誘導(dǎo)分化為其他干細(xì)胞[22],但目前尚無(wú)證據(jù)證明早期和晚期EPCs能相互轉(zhuǎn)化,所以前期研究中發(fā)現(xiàn)的外周血EPCs是否部分或全部來(lái)源于骨髓,仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

另外,老年人的ECs損傷速率較年輕人快,這樣持續(xù)性的細(xì)胞損傷或機(jī)能異常會(huì)導(dǎo)致EPCs永久性的缺失或衰竭,而我們的EPCs可能是有限的[23]。因此運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的EPCs增多究竟是“一過(guò)性”還是“永久性”的,仍需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

(1)中老年大鼠經(jīng)有氧運(yùn)動(dòng)后,其骨髓來(lái)源的MNCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的EPCs可被Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1良好標(biāo)記與鑒定。

(2)16周規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)能促進(jìn)中老年大鼠骨髓來(lái)源的EPCs增殖。

衷心感謝中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室祝和成教授與吳尚輝老師、湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院吳秀山教授以及湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊華中和任翔老師在作者實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的指導(dǎo)和支持!

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Effects of Aerobics on Proliferative Capacity in Endothelial Progenitor Cells from Bone M arrow of O ld M ale Rats

GONGXiao-Ming,et all
(Sichuan University of Science&Engineering,Zigong Sichuan,643000)

Objective:The paper is to explore the effects of aerobics on proliferative capacity in endothelial progenitor cells from bonemarrow of old male rats.Method:12 old male Sprague-Dawley rats are randomly and averagely divided into 2 groups,the control group and the aerobics group.The aerobic exercise mode is established by using the methods of lactic acid threshold and incremental treadmill exercise.Mononuclear cells from bonemarrow are obtained by density gradient centrifugation 12 hours after the scheme has ended up.The cells are suspended in conditioned medium EGM-2 for culturing in vitro.Their phenotypes are confirmed by uptake of acetylated LDL and binding of fluorescein isothiocyanate(FITC)-labeled Ulex europaeus agglutinin 1(UEA-1)lectin.Inverted microscope observation is adopted to understand the morphological changes of endothelial progenitor cells and to calculate cells count and colony forming efficiency,so that the proliferation situation of endothelial progenitor cells is obtained.Results:Adherent cells increasemore obviously than group control both at48h and day 7(P＜0.01).The number of adherent cells and colony forming efficiency in aerobics group ismore than that in the control groups(P＜0.01).Conclusion:Proliferative capacity of endothelial progenitor cells from bonemarrow in old male rats can be developed by aerobic exercise.

aerobic exercise:endothelial progenitor cells:bonemarrow;cell culture;proliferation

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0060-04

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0060-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目號(hào):30671011);中國(guó)博士后科學(xué)基金(項(xiàng)目號(hào):20080430155);教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(2009年)

龔曉明(1981-),女,四川樂(lè)山人,碩士,講師,主要從事運(yùn)動(dòng)的心血管適應(yīng)機(jī)理研究。

2014-03-30