李盛村,王國祥

(蘇州大學(xué)體育學(xué)院,江蘇 蘇州 325000)

跳躍性應(yīng)力刺激對大鼠血清PTH及骨代謝相關(guān)分子OPG、RANKL的影響

李盛村,王國祥

(蘇州大學(xué)體育學(xué)院,江蘇 蘇州 325000)

目的:研究長期跳躍應(yīng)力刺激對甲狀腺激素(PTH)和骨代謝相關(guān)分子基因表達(dá)的影響,探討跳躍運(yùn)動所致的骨質(zhì)破壞發(fā)生分子機(jī)制。方法:48只8周齡雄性SD大鼠,隨機(jī)分為對照組、跳躍組和負(fù)重跳躍組,運(yùn)動2周后每組取材8只,記為C2、J2和JL2,運(yùn)動6周后各組,記為C6、J6和JL6。跳躍組進(jìn)行遞增負(fù)荷跳躍運(yùn)動,負(fù)重跳躍組負(fù)重5%自身體重,運(yùn)動方案同跳躍組。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清甲狀旁腺激素(PTH),采用比色法檢測血清堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸(StrACP)含量。取一側(cè)脛骨制作HE石蠟切片,另一側(cè)應(yīng)用RT-PCR法檢測OPG、RANKL的mRNA表達(dá)。結(jié)果:(1)與C6和J6組相比,JL6組骨膠原纖維和骨膜排列紊亂,骨皮質(zhì)出現(xiàn)較大程度破壞,空腔增多。(2)JL6組血清ALP高于J6和C6組(p＜0.01,p＜0.05)。JL6組和J6組StrACP顯著高于C6組(p＜0.01)。(3)J2和JL2 PTH水平組顯著低于C2組(p＜0.05,p＜0.01),JL6組低于J6和C6組(p＜0.05,p＜0.01)。(4)與C6組比較,J6組和JL6組OPGmRNA表達(dá)顯著升高,其中J6組表達(dá)量最高。JL6組RANKL表達(dá)顯著高于J6和C6組(p＜0.01),J6組RANKL的表達(dá)高于C6組(p＜0.05)。結(jié)論:負(fù)重跳躍運(yùn)動6周后大鼠脛骨骨質(zhì)破壞較為嚴(yán)重,骨代謝以骨轉(zhuǎn)換率升高為特征,RANKL的持續(xù)升高可能是骨質(zhì)破壞的重要原因,而血清PTH水平持續(xù)下降不利于骨質(zhì)修復(fù)。

跳躍性應(yīng)力;甲狀旁腺激素;OPG/RANKL

適宜應(yīng)力刺激是維持骨骼健康生長的必要前提,運(yùn)動過程中的過度應(yīng)力刺激則可以導(dǎo)致骨質(zhì)破壞而發(fā)生骨損傷,如疲勞性骨折、創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎以及骨質(zhì)疏松等。運(yùn)動實(shí)踐發(fā)現(xiàn),跳躍性應(yīng)力刺激是引起骨損傷最常見的方式,例如在籃球、排球和跨欄等運(yùn)動員中應(yīng)力性骨折發(fā)生率最高。諸多研究證實(shí)[1],應(yīng)力刺激可以通過力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路,直接對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能產(chǎn)生影響,而護(hù)骨素(Osteoprotegerin,OPG)和核因子-κB受體激活因子配體(Receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)則被認(rèn)為是力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的應(yīng)力敏感信號分子。甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)是重要的骨代謝相關(guān)激素,已成為臨床上治療骨質(zhì)疏松的主要藥物之一[2]。生理狀況下,OPG和RANKL的動態(tài)平衡是維持骨量的重要因素;在過度應(yīng)力下PTH可能調(diào)節(jié)OPG/ RANKL比例,從而影響骨代謝。目前國內(nèi)外有關(guān)過度應(yīng)力刺激與骨損傷發(fā)生的相關(guān)研究較少,應(yīng)力刺激影響骨重建和骨破壞的途徑和分子機(jī)制尚不清楚。

因此,本實(shí)驗(yàn)以大鼠背部負(fù)重形式,建立過度跳躍性應(yīng)力所致的骨質(zhì)破壞大鼠模型,觀察大鼠脛骨形態(tài)學(xué)的變化,檢測血清骨代謝生化指標(biāo)ALP、StrACP濃度和PTH水平,此外檢測脛骨OPG和RANKLmRNA表達(dá),分析PTH、OPG和RANKL在骨代謝中的作用,以期為揭示過度應(yīng)力所致骨質(zhì)破壞的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為靶向預(yù)防和治療運(yùn)動性骨損傷提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

8周齡雄性SD大鼠48只,購自蘇州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料飼養(yǎng),動物房室溫22±6℃,相對濕度45±5%,每日按照自然晝夜照明,光照時(shí)間每天12小時(shí)。大鼠隨機(jī)平均分為普通跳躍組、負(fù)重跳躍組和對照組。實(shí)驗(yàn)2周時(shí)各組處死8只大鼠并取材,分別記為跳躍2周組(J2),負(fù)重跳躍2周組(JL2)和對照2周組(C2),實(shí)驗(yàn)6周時(shí)處死剩余大鼠,記為跳躍6周組(J6),負(fù)重跳躍6周組(JL6)和對照6周組(C6)。跳躍組大鼠置于自制跳躍電刺激籠內(nèi),按運(yùn)動方案進(jìn)行跳躍運(yùn)動。負(fù)重跳躍組大鼠按自身體重5%重量,系上鉛粉背包,并進(jìn)行與跳躍組相同的運(yùn)動方案。對照組安靜飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器

自制大鼠跳躍籠及刺激裝置:長寬高為1.2米,頂部沒有遮蓋,分割出4個(gè)室,四周為光滑塑料板材料,底部板上布置平行排列的細(xì)銅條,將間隔銅條串聯(lián),外部連接變壓器和半自動通電裝置,能夠按照運(yùn)動方案要求自動通電和斷電以及通電總時(shí)間,輸出電壓設(shè)置為35-55v。大鼠足部接觸通電銅條,將向上跳躍,回落至底板時(shí)停止通電,進(jìn)入下一個(gè)通電循環(huán)。按照“低電壓,長間隙”方式,減輕大鼠電應(yīng)激反應(yīng),以模擬真實(shí)跳躍運(yùn)動。

1.3 跳躍運(yùn)動方案

按遞增負(fù)荷進(jìn)行每周6天運(yùn)動訓(xùn)練,J2組和JL2組參與2周跳躍運(yùn)動,J6和JL6組參與6周跳躍運(yùn)動。運(yùn)動方案為1-2周:每15秒通電2秒,40個(gè)循環(huán)(10分鐘)為一組,組間休息5分鐘,持續(xù)運(yùn)動6組,總運(yùn)動時(shí)間為1小時(shí)。以此類推,3-4周總運(yùn)動時(shí)間為1.5小時(shí),5-6周總運(yùn)動時(shí)間為2小時(shí)。

1.4 指標(biāo)測試及方法

1.4.1 檢測材料的制備

(1)各組大鼠完成最后一次運(yùn)動結(jié)束24小時(shí)后,用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后,經(jīng)心臟取血5ml,3000 rpm/min離心20分鐘,血清置于-20℃冰箱保存待測。

(2)取一側(cè)脛骨于10%福爾馬林溶液中保存,用于石蠟切片。取另一側(cè)脛骨,于-80℃冰箱保存待測。

1.4.2 指標(biāo)檢測方法

(1)HE染色及切片觀察:使用德國Leica-EG1160型全自動石蠟包埋機(jī)對大鼠脛骨進(jìn)行包埋,使用Leica-RM2145型石蠟切片將蠟塊進(jìn)行縱向連續(xù)切片,切片厚度5um,HE染色。

(2)生化指標(biāo)檢測:應(yīng)用722分光光度計(jì),采用比色法獲取ALP和StrACP濃度值。按照PTH Elisa測定試劑盒操作說明,檢測大鼠血清PTH濃度。

(3)mRNA檢測:截取大鼠脛骨中段,剔除骨膜以及骨髓腔軟組織,使用磨骨鉗將骨質(zhì)碾磨至粉狀。骨組織總RNA提取參照Trizol試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書進(jìn)行。采用real time PCR法擴(kuò)增檢測目的基因表達(dá),引物序列如表1所示。目的基因(OPG、RANKL)的Ct值減去內(nèi)參GAPDH的Ct值得到ΔCt值,基因的相對表達(dá)量用2-ΔCt來表示。

表1 基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示。采用單因素方差分析進(jìn)行三組之間差異顯著性檢驗(yàn),采用最小有意義差異法(LSD)進(jìn)行組內(nèi)差異性檢驗(yàn),P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脛骨形態(tài)學(xué)比較

C2和C6組大鼠骨膜完整平滑,骨膠原纖維排列整齊,骨質(zhì)緊密均勻,骨細(xì)胞分布均勻,未見空泡明顯增加(圖1:C2和C6)。J2和JL2組,大鼠膠原纖維較為完整和規(guī)則,但是空泡數(shù)量和大小均開始增加(圖1:J2和JL2)。與J6和C6組相比,JL6組骨膠原纖維和骨膜排列紊亂,空腔明顯增多,骨皮質(zhì)出現(xiàn)較大程度破壞,骨膜排列雜亂(圖1:C6、J6和JL6)。

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果

2.2 骨代謝生化指標(biāo)和血清PTH變化

2.2.1 骨代謝生化指標(biāo)

運(yùn)動2周各組ALP水平無顯著性差異(p＞ 0.05)。運(yùn)動6周后,JL6組ALP水平顯著高于C6組和J6(p＜0.01,p＜0.05)。跳躍組和負(fù)重跳躍組的StrACP水平均顯著高于對應(yīng)對照組,負(fù)重跳躍高于跳躍組,但無顯著性差異(表2)。

表2 各組大鼠血清ALP和StrACP比較

2.2.2 大鼠血清PTH

JL2組PTH水平顯著低于J2和C2組(p＜0.05,p＜0.01),J2組低于C2組(p＜0.05)。6周后,各組PTH水平均低于對應(yīng)組別2周時(shí)水平。JL6組PTH水平顯著低于J6和C6組(p＜0.05,p＜0.01),J6組低于C6組(p＜0.05)(表3)。

表3 各組大鼠血清PTH比較

2.3 大鼠脛骨OPG、RANKL的表達(dá)

在2周時(shí),三組骨OPGmRNA表達(dá)量差異不顯著,而6周時(shí),J6組和JL6組OPGmRNA表達(dá)顯著升高(表4,圖2)。JL6組RANKL表達(dá)顯著高于J6和C6組(p＜0.01),J6組表達(dá)高于C6組(p＜0.05)(表4,圖3)。

表4 各組大鼠脛骨OPG和RANKLmRNA相對表達(dá)比較

圖2 各組大鼠脛骨OPGmRNA相對表達(dá)比較

圖3 各組大鼠脛骨RANKLmRNA相對表達(dá)比較

3 分析與討論

3.1 跳躍運(yùn)動對大鼠骨骼形態(tài)學(xué)和骨代謝的影響

運(yùn)動對骨骼結(jié)構(gòu)和功能的影響是復(fù)雜的,不同運(yùn)動持續(xù)時(shí)間和運(yùn)動強(qiáng)度以及運(yùn)動方式均會產(chǎn)生不同的效益[3]。運(yùn)動所致骨質(zhì)破壞的發(fā)生機(jī)制,目前存在兩種主要的觀點(diǎn):一是長期運(yùn)動導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,繼而引發(fā)骨代謝異常;二是應(yīng)力刺激直接調(diào)控骨骼相關(guān)力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對骨功能細(xì)胞產(chǎn)生影響,繼而產(chǎn)生骨代謝紊亂。有趣的是,研究發(fā)現(xiàn)8周跳躍運(yùn)動比游泳運(yùn)動更加能夠改善去卵巢大鼠脛骨生物力學(xué)性能和骨密度,進(jìn)一步的研究認(rèn)為游泳運(yùn)動對生長期大鼠腰椎生長發(fā)育有明顯作用,而對股骨和脛骨作用不明顯[4]。因此,跳躍運(yùn)動對骨的局部刺激效果更加明顯,我們的實(shí)驗(yàn)從脛骨取材和檢測有利于骨質(zhì)破壞機(jī)制的探討。

研究表明長期臥床可以形成廢用性骨質(zhì)疏松癥,而適度運(yùn)動刺激有利于骨密度和骨量的維持[5]。然而,過度運(yùn)動訓(xùn)練或過度負(fù)荷會導(dǎo)致骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加(如應(yīng)力性骨折),骨量減少。陳曉紅[6]等研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)15周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動,引起大鼠脛骨骨密度先增加后減少,脛骨上段骨小梁面積百分比和骨小梁厚度先輕微上升后下降,表明大負(fù)荷運(yùn)動導(dǎo)致骨質(zhì)破壞,明顯加劇骨吸收和骨形成,骨量降低,骨代謝呈高轉(zhuǎn)換特征。

大鼠生長期血清ALP主要來源于骨,能夠用于評價(jià)成骨細(xì)胞活躍程度,推斷骨形成水平,此外,大量研究指出骨吸收增加,StrACP濃度增高[7]。適宜強(qiáng)度8周縱跳運(yùn)動比游泳運(yùn)動更加有效促進(jìn)大鼠腰椎和股骨的骨密度,并且ALP和TRACP明顯升高[4]。曹鵬[8]通過比較不同負(fù)荷跑臺運(yùn)動對老齡大鼠骨量及骨代謝指標(biāo)發(fā)現(xiàn),大強(qiáng)度組10周跑臺運(yùn)動,血清ALP水平升高最顯著,但是骨密度改善不明顯。本實(shí)驗(yàn)中C2組測定的ALP水平高于C6組數(shù)值,而StrACP的數(shù)值較為穩(wěn)定,這表明8周齡大鼠處于生長期,骨代謝本身以保留型骨重建為主。負(fù)重跳躍訓(xùn)練6周后StrACP和ALP水平顯著高于J6和C6組,這表明過度跳躍應(yīng)力刺激引起破骨細(xì)胞活性顯著增加,聯(lián)系JL6組的組織形態(tài)學(xué)改變,提示出現(xiàn)以骨代謝轉(zhuǎn)換率升高為特點(diǎn)的骨質(zhì)破壞過程。

3.2 跳躍運(yùn)動對大鼠血清PTH的影響

應(yīng)用機(jī)械載荷和PTH局部注射的方法對大鼠骨折處進(jìn)行處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種干預(yù)手段聯(lián)合應(yīng)用時(shí),成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性增加最為明顯,且骨密度和骨量隨之增加,值得注意的是PTH單獨(dú)處理后,也能加強(qiáng)早期成骨細(xì)胞活性,增加骨礦化和總骨量[9]。同樣,Ellegaard等[10]研究發(fā)現(xiàn)通過對骨折大鼠局部注射PTH(1-34),促進(jìn)骨折康復(fù),而且不存在力學(xué)刺激下也發(fā)揮出PTH的促骨形成效益。因此,PTH具有促進(jìn)成骨細(xì)胞活性而具有愈合骨折的作用,反之生理性PTH減少也不利于骨骼健康發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)中PTH在C2組高于C6組的原因可能是由于生長期大鼠體內(nèi)整體代謝旺盛,而引起PTH升高[11]。JL6和J6組中隨著跳躍負(fù)荷強(qiáng)度增加和時(shí)間延長PTH持續(xù)下降,特別是JL6組PTH下降更加顯著。跳躍組PTH的下降可能與破骨細(xì)胞活躍有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)破壞的骨組織中骨吸收占主導(dǎo)作用,引起Ca2+釋放入血增加,機(jī)體通過負(fù)反饋系統(tǒng)減少PTH分泌,PTH分泌減少又進(jìn)一步減少小腸對Ca2+的吸收,不利于骨礦沉積[12]。而且,PTH分泌減少又對成骨細(xì)胞活性刺激減弱,不利于破壞骨質(zhì)的康復(fù)[13]。綜上認(rèn)為,在過度跳躍運(yùn)動后PTH分泌減少,可以通過內(nèi)分泌系統(tǒng)介導(dǎo)而不利于鈣離子攝入和新骨形成的增加,最終加劇骨質(zhì)破壞過程。

3.3 跳躍運(yùn)動對脛骨OPG和RANKL表達(dá)的影響

盡管PTH等激素對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的直接調(diào)控的分子機(jī)制目前仍不完全清楚,但是力學(xué)敏感信號通路中的某些分子可能是激素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在骨組織中,多種因素均可以通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL之間的平衡而影響骨的生理和病理代謝。成骨/基質(zhì)細(xì)胞分泌RANKL,可以和破骨細(xì)胞前體或破骨細(xì)胞表面的受體RNAK結(jié)合,繼而促進(jìn)破骨的分化成熟及活性增強(qiáng),骨吸收代謝可隨之增強(qiáng);成骨細(xì)胞分泌的OPG可以與RANK競爭性結(jié)合RANKL,阻礙RANKL與RANK之間的結(jié)合,從而抑制破骨細(xì)胞的活性,起到保護(hù)骨組織作用[14]。實(shí)驗(yàn)表明,如果RANKL過度表達(dá)和/或OPG異常降低,導(dǎo)致骨吸收代謝過度增強(qiáng),可產(chǎn)生以骨量丟失和骨質(zhì)破壞為特征的骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等骨代謝疾病[15]。李春雯[16]研究指出強(qiáng)骨膠囊可以提高骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨密度及血清OPG含量,同時(shí)改善大鼠脛骨生物力學(xué)性能,但可以降低RANKL濃度。趙仁清[17]研究了7周大負(fù)荷運(yùn)動對大鼠血清OPG和sRANKL及骨代謝生化因的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大負(fù)荷運(yùn)動后血清OPG下降而RANKL上升,并且指出OPG/sRANKL比值下降,引起破骨細(xì)胞增多是骨密度下降的原因。由上述研究可知,不管是過度負(fù)荷還是內(nèi)分泌因素異常占主導(dǎo)作用而引起的骨質(zhì)破壞,OPG/ RANKL的變化可能是其共同的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,跳躍運(yùn)動6周后OPG表達(dá)顯著升高,且跳躍組高于負(fù)重跳躍組,而負(fù)重跳躍組的RANKL表達(dá)顯著高于6周跳躍組和對照組。與上述實(shí)驗(yàn)抑制,跳躍組和負(fù)重跳躍組OPG/RANKL比值下降,可能引起破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。與普通跳躍組相比,負(fù)重跳躍組由于自身負(fù)重,所受過度應(yīng)力刺激不僅RANKL升高更加顯著,骨質(zhì)形態(tài)學(xué)破壞也更加明顯。

綜上所述,過度的跳躍性應(yīng)力刺激能夠?qū)е鹿琴|(zhì)破壞發(fā)生,該過程以骨吸收大于骨形成的骨代謝轉(zhuǎn)換率升高為特征。RANKL在過度應(yīng)力刺激中通過激活破骨細(xì)胞活性,增強(qiáng)骨吸收,而血清PTH濃度持續(xù)下降影響破壞骨質(zhì)的康復(fù)。繼續(xù)深入研究骨代謝應(yīng)力敏感信號通路,以及信號分子與內(nèi)分泌激素之間的內(nèi)在聯(lián)系機(jī)制,有利于闡明骨質(zhì)破壞發(fā)生的分子機(jī)制。

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Effect of Jumping Stress on the PTH and OPG/RANKL of Bone M etabolism in Rats'Tibia

LISheng-Cun,WANGGuo-Xiang
(Suzhou University,Suzhou,Jiangsu 325000)

objective:To investigate the effects of jumping stress stimulation on the parathyroid hormone(PTH)and molecules expression of OPG and RANKL related to bone metabolism in Rat's Tibias,and to explore the molecular mechanism of bone destruction.Methods:48 eight-week old SD ratswere equally randomized into control group(C), jump group(J)and loading jump group(JL).After twoweeks,8 ratswere taken from three groups,marked as:C2,J2 and JL2 groups and after six weeks the rest taken and marked as:C6,J6 and JL6.Jgroup participated in incremental load training,JL group gained 5%of body weight load whose training plan was the same with the J6 group and the C group was not treated.The serum PTH levels weremeasured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Alkaline phosphatase(ALP)and anti-tartaric acid acidic phosphoric acid(StrACP)in serum were assayed by colorimetric method.One side tibia wasmade HE paraffin section,the other side was assayed themRNA expression of IL-6,OPG and RANKL by RT-PCR.Results:(1)Compared with C6 and J6,collagen fibers of periost were disordered with a larger degree of damage to the cortical bone,the cavitys increases in JL6 group.(2)The serum ALP and StrACP levels in three jumping groupswere significantly higher compared with those in control groups(p＜0.05).The serum StrACP levels in JL6 and J6 groupswere significantly higher compared with those in C6 groups(p＜0.05).(3)Compared with the C2 group,the level of PTH was significantly lower in the J2 and JL2 groups(p＜0.05).The serum PTH level in JL6 group was significantly lower compared with that in C6 and J6 groups(p＜0.05).(4)The mRNA expression of OPG in JL6 and J6 groupswere higher than in C6(p＜0.05),and itwas the highest in J6 group.ThemRNA expression of RANKL was significantly higher in JL6 group than in the C6 and J6 groups(p＜0.01).Conclusions:Bone de-struction characterized by higher bone turnover in rats'tibiaswas severe after 6 weeks of loaded jump because of the increased expression of RANKL.The decreased level of PTH is not helpful for the heal of bone destruction.

jumping stress;PTH;OPG/RANKL

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0069-05

G804.2

:A

:1001-9154(2014)10-0069-05

蘇州市科技計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(SYS201312)

李盛村(1985-),男,浙江省溫州市人,漢族,蘇州大學(xué)體育學(xué)院在讀博士研究生,研究方向:運(yùn)動醫(yī)學(xué)。

2014-06-20