朱選風(fēng)，蘇 梅，丁文筱，丁 寧，黃 茂，張希龍*

(1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，南京 212029；2江蘇省老年醫(yī)院呼吸科，南京 212004)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)作為一種現(xiàn)代常見病，其病理特征為睡眠期反復(fù)發(fā)生上氣道塌陷，導(dǎo)致體內(nèi)的慢性間歇性低氧(chronic intermittenthypoxia，CIH)進(jìn)而可引起多種OSAHS并發(fā)癥，其中以心血管并發(fā)癥最為常見，已成為中老年心血管疾病的常見誘因之一。已有報(bào)道OSAHS與心功能紊亂有關(guān)而持續(xù)氣道正壓(continuous positive airway pressure，CPAP)治療OSAHS可改善該心功能紊亂[1?3]。然而，OSAHS與心功能紊亂的相關(guān)機(jī)制尚不完全明了，有待探討和發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。由于諸多OSAHS患者尚不能依從CPAP治療，Matsumoto等[4]報(bào)道間歇性低氧可誘導(dǎo)左心室重構(gòu)。其他報(bào)道也顯示氧化應(yīng)激、TGF-β和炎癥因子可能在左心室重構(gòu)中起到重要的作用[5]。Kim等[6]報(bào)道阻塞性睡眠呼吸左心室結(jié)構(gòu)和功能重構(gòu)有關(guān)。

脂聯(lián)素(adiponectin，Ad)是新近發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種蛋白質(zhì)，是所有脂肪細(xì)胞因子中唯一負(fù)性調(diào)節(jié)的激素，具有降糖、增加胰島素敏感性、抗炎、抗動(dòng)脈硬化等作用[7?9]，與冠心病等疾病密切相關(guān)，已成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[10]。新近研究發(fā)現(xiàn)Ad與OSAHS關(guān)系密切，OSAHS患者存在低Ad血癥，且CIH可導(dǎo)致低Ad血癥，提示Ad極可能在OSAHS發(fā)病、發(fā)展中起著不可忽視的作用[11]。

已有報(bào)道Ad具有心臟保護(hù)作用，Ad通過(guò)激活PPARα可以防止血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化[12]。然而，CIH與左心室重構(gòu)之間的關(guān)系以及Ad的可能干預(yù)作用尚未闡明。本研究通過(guò)建立大鼠的CIH模型探討相關(guān)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取的45只成年雄性Wistar大鼠(SPF級(jí))由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)在恒溫(24℃)鼠房，12h∶12h晝夜循環(huán)。大鼠可自由接觸食物和水。這項(xiàng)研究經(jīng)過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的許可。

1.2 CIH造模

45只大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(normal control group，NC)、CIH組及CIH＋Ad組。將CIH和CIH＋Ad組大鼠飼養(yǎng)在一個(gè)特殊的玻璃艙內(nèi)，連接一個(gè)氣體控制系統(tǒng)，控制氮?dú)夂涂諝膺M(jìn)入艙內(nèi)。120s為一個(gè)循環(huán)，前60s沖入氮?dú)?，使艙?nèi)氧氣濃度下降到5%，后面60s沖入空氣，使氧氣濃度逐漸恢復(fù)到20%。8h/d，持續(xù)35d。NC組大鼠放入相同的玻璃艙，持續(xù)沖入空氣。同時(shí)，CIH＋Ad組大鼠接受Ad治療，2次/周，持續(xù)5周。每只大鼠每次尾靜脈注射Ad 10μg，NC和CIH組大鼠尾靜脈注射生理鹽水。

1.3 組織處理

造模結(jié)束，使用戊巴比妥麻醉大鼠。打開胸腔，將心臟組織迅速分離，一部分被保存在-70℃，另一部分保存在4%多聚甲醛中。

1.3.1 Masson染色分析 使用Masson染色分析來(lái)檢測(cè)心臟纖維化程度。將心臟組織脫水，包埋后，使用切片機(jī)切成5μm厚的石蠟切片。切片脫蠟和水化后，將其在R1中孵育1min，然后在R2中孵育30s，接下來(lái)在R3中孵育8min。最后在R4中孵育5min，封片，鏡檢。為了評(píng)估心臟組織的纖維化程度，每張切片取10個(gè)高倍鏡視野(400×)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析 將100mg左心室組織加入1ml TRIzol試劑(Invitrogen，USA)后勻漿，按照TRIzol法提取總的RNA。大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)?2引物序列(Invitrogen，USA)：正向(5'-AGGGCACCTCTTACAACAGC-3')；反向(5'-CCCGGTCATAATCCTCGGTG-3')。大鼠TIMP-2(Invitrogen，USA)引物序列：正向( 5'-CAACCCCATCAAGAGGATTC-3')； 反 向( 5'-CGCAAGAACCATCACTTCTC-3')。 大 鼠β-actin(Invitrogen，USA)引物序列：正向(5'-CAGGGTGTGA TGGTGGGTATGG-3')；反向(5'-AGTTGGTGACAATGCCGTGTTC-3')。所有基因PCR擴(kuò)增的熒光信號(hào)都以β-actin作為對(duì)照，使用2-△△CT法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 Western blot分析 使用含有氧化硫酰苯甲醇(PMSF)(1mmol/L)和磷酸酶抑制劑混合物(Roche，Germany)的組織蛋白提取試劑(Thermo Scientific，USA)提取左心室蛋白。將30mg組織放入300μl裂解液中制成勻漿。然后將勻漿物離心(10 000×g)5min，收集上清液即為左心室蛋白。10%凝膠分離總蛋白，各組上樣量均為30μg。將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%BSA、0.1%Tween-20，pH為7.6的TBS室溫封閉1h。然后將PVDF膜置于β-actin、膠原蛋白(collagen)Ⅰ、Ⅲ、TGF-β、smad2/3兔單抗緩沖液于4℃過(guò)夜。再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔孵育2h。最后使用增強(qiáng)型ECL試劑盒(Thermo Scientific，USA)檢測(cè)條帶，并利用數(shù)字成像系統(tǒng)(Image lab)進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CIH對(duì)心肌纖維化的影響

CIH第35天結(jié)束時(shí)，心肌組織經(jīng)Masson染色分析顯示，CIH組的左心室心肌纖維化面積較NC組和CIH＋Ad組顯著擴(kuò)大(P＜0.05)，NC組和CIH＋Ad組之間差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；圖1)。以Western blot方法檢測(cè)的左心室心肌膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)在CIH組最高，NC組最低而CIH＋Ad組居中。3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；圖2)。

圖1 左心室心肌Masson染色分析Figure 1 The Masson analysis of the left ventricular myocardium(400×)

2.2 與CIH誘導(dǎo)心肌纖維化的相關(guān)分子表達(dá)

在發(fā)現(xiàn)CIH可誘導(dǎo)左心室心肌纖維化后，我們進(jìn)一步探討了TGF-β/smad2/3通道是否與此纖維化有關(guān)。以Western blot方法檢測(cè)TGF-β和磷酸化smad2/3發(fā)現(xiàn)，盡管NC和CIH＋Ad組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但CIH組較其他兩組均顯著增高(P＜0.05；圖3)。我們還檢測(cè)到基質(zhì)金屬蛋白酶?2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和MMP-9的基因水平雖然NC和CIH＋Ad組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但CIH組較其他兩組均顯著增高(均P＜0.05)。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑?1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)和TIMP-2的基因表達(dá)水平在NC組最高，CIH組最低，而CIH＋Ad組居中。3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；圖4)。

圖2 膠原蛋白Ⅰ和膠膠原蛋白Ⅲ的蛋白質(zhì)水平Figure 2 The protein levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ

3 討論

本研究通過(guò)建立大鼠CIH模型探討了Ad對(duì)CIH左心室重構(gòu)的影響及Ad的干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在35d的CIH暴露之后，CIH的確可以誘導(dǎo)出左心室重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌纖維化的面積增大以及心肌組織中膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的蛋白表達(dá)增強(qiáng)。而在同樣暴露于CIH但補(bǔ)充了外源性Ad的CIH+Ad組，左心室重構(gòu)現(xiàn)象得到緩解。其機(jī)制可能與Ad抑制了TGF-β/smad2/3通路有關(guān)。

眾所周知OSAHS是多種心血管疾病的危險(xiǎn)因素[12]。已有報(bào)道提示CIH可以誘導(dǎo)小鼠或大鼠發(fā)生左心室重構(gòu)[4,13?15]。本研究證實(shí)了該病理改變，發(fā)現(xiàn)了CIH組大鼠增強(qiáng)的左心室纖維化。由于我們?cè)l(fā)現(xiàn)CIH可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡[16]，因而推測(cè)氧化應(yīng)激可能也是形成左心室重構(gòu)的重要因素[17]。然而，隨著對(duì)暴露于CIH的大鼠補(bǔ)充外源性Ad，本研究又發(fā)現(xiàn)心肌纖維化的指標(biāo)得到改善。Ad具備心肌保護(hù)作用已有較多報(bào)道[10,18?20]。Fujita等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Ad能夠保護(hù)心肌，防止由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化發(fā)生。Shimano等[21]的研究顯示，Ad基因敲除的小鼠與WT小鼠相比，在TAC手術(shù)后表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的左心室間充質(zhì)纖維化。因而提示Ad可能緩解心肌纖維化和心臟質(zhì)量(heart mass，HS)/體質(zhì)量(body mass，BS)比率。

圖3 TGF-β/smad2/3通道的蛋白水平Figure 3 The protein levels of TGF-β/smad2/3 pathway

圖4 3組間心肌組織的MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)水平Figure 4 The mRNA levels of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 in myocardial tissues of three groups

MMPs作為降解心肌細(xì)胞外蛋白的一族蛋白溶解酶，是一類與左心室重構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)，從mRNA水平可以檢測(cè)出MMPs是否增高[4,22]。與以往的報(bào)道相似，本研究發(fā)現(xiàn)CIH可以誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9的mRNA水平增高。TIMP系一種局部合成的蛋白質(zhì)，附著于活化的MMPs來(lái)調(diào)控蛋白水解活性[22]。在暴露于CIH35d后，TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平降低了，而在補(bǔ)充了Ad的大鼠中，盡管同樣暴露于CIH，TIMP-1和TIMP-2的mRNA水平降低卻部分改善了，該現(xiàn)象提示Ad保護(hù)心肌防止纖維化。

本研究結(jié)果顯示，Ad能改善CIH誘導(dǎo)的左心室重構(gòu)。TGF-β，作為一種多效細(xì)胞因子，與許多生物過(guò)程如細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、胚胎發(fā)育、纖維化、細(xì)胞增殖與生存和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等有關(guān)[23]。TFG-β信號(hào)經(jīng)過(guò)跨膜受體激活smad2/3磷酸化，使磷酸化的smad2/3復(fù)合體轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)，然后誘導(dǎo)纖維前靶基因表達(dá)[23?25]。有報(bào)道顯示[24]，TGF-β信號(hào)在心臟重構(gòu)中起到重要的作用，而且TGF-β的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)細(xì)胞間基質(zhì)蛋白合成[26,27]。本研究發(fā)現(xiàn)CIH可以誘導(dǎo)TGF-β信號(hào)加強(qiáng)，而補(bǔ)充Ad卻能減輕TGF-β與smad2/3的表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果提示，Ad可以保護(hù)心肌，減輕CIH誘導(dǎo)的左心室重構(gòu)。Ad的確切心臟保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究予以闡明。

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