韓金友　袁道英

【摘要】目的：探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促進(jìn)成骨缺損修復(fù)的機(jī)制。方法：雄性新西蘭大白兔 24只，體重1.5～2.0 kg。在兔顱骨兩側(cè)分別建立一個(gè)1cm×0.5cm全層骨缺損區(qū)，同時(shí)去除該區(qū)骨膜、保護(hù)硬腦膜。隨機(jī)選擇一側(cè)骨缺損作實(shí)驗(yàn)側(cè)，植入復(fù)合PRP 的ABM；另一側(cè)為對(duì)照側(cè)，僅植入ABM。術(shù)后第2、4、8、12 周末分別處死兔6只取材。免疫組織化學(xué)法測(cè)定骨缺損修復(fù)區(qū)域血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)； Image-proplus 5.0圖像分析軟件做VEGF表達(dá)強(qiáng)度的灰度測(cè)量。采用SSPS 16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：兩組相比，在第2、4周時(shí)差異均有顯著性（P <0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在實(shí)驗(yàn)組早期階段的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明血管形成活躍。PRP促進(jìn)骨修復(fù)的作用發(fā)生在植入后早期，啟動(dòng)了早期活躍的成骨。

【關(guān)鍵詞】脫細(xì)胞骨基質(zhì)；骨缺損修復(fù)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；兔

【中圖分類號(hào)】R651.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）03-0010-01

骨缺損的修復(fù)是骨組織再生的過(guò)程，其基礎(chǔ)則是傷口血管的形成和生長(zhǎng)，血管的長(zhǎng)入在組織修復(fù)中起著不可或缺的作用[1] 。修復(fù)過(guò)程中，在復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制作用下，各種各樣的細(xì)胞因子在不同的骨缺損愈合階段發(fā)揮各自不同的功能。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF） 是最重要的促血管生成因子[2] ，在骨缺損愈合過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本文以兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察VEGF在骨缺損修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)、分布及其促進(jìn)成骨的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

雄性新西蘭大白兔 24只（山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供），質(zhì)量1.5～2.0 kg。牛凝血酶（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；10%枸椽酸鈉（濟(jì)南天和化工有限公司）；10%氯化鈣（濟(jì)南天和化工有限公司）；ABM（上海市組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1.2 兔顱骨缺損區(qū)制備

3%的戊巴比妥鈉按1mL/kg兔耳緣靜脈注射麻醉成功后，顱頂部備皮，手術(shù)區(qū)常規(guī)消毒鋪無(wú)菌巾單。耳前眶后正中部位切開(kāi)皮膚及皮下組織，于骨膜上向兩側(cè)分離皮膚及皮下組織，中線處切開(kāi)骨膜，向兩側(cè)游離至擬制備骨缺損范圍稍外處切除之。用牙科微動(dòng)力牙鉆分別于顱正中縫左右兩側(cè)約0.5cm處各制備1.0cm×0.5cm的顱骨全層缺損，制備過(guò)程中以無(wú)菌生理鹽水降溫，并注意勿損傷硬腦膜，沖冼術(shù)區(qū)碎骨屑，無(wú)菌鹽水紗布覆蓋。

1.3 PRP制備、活化及與ABM復(fù)合

0.15g無(wú)菌ABM顆粒置于無(wú)菌托盤待用。按Marx等[3]所介紹的兩次離心方法制備PRP。耳中央動(dòng)脈抽取全血5mL，注入預(yù)先放入0.3 mL枸椽酸鈉的無(wú)菌試管，2500r/min離心10min，取上清液至中間層以下1mm處移至另一無(wú)菌試管，再次以3000r/min離心10min，棄去上2/3，余下的1/3為約0.5mL PRP。10%無(wú)菌CaCl2溶液0.5mL溶解牛凝血酶50IU制備成PRP活化劑溶液，2mL注射器吸取該溶液0.3mL，PRP 0.5ml和1ml空氣，混勻后轉(zhuǎn)移至ABM顆粒處并與之充分混合。靜置1-2 min，混合物即成膠凍狀?？梢?jiàn)ABM顆粒均勻分布于膠凍狀物質(zhì)中，表示PRP活化并與ABM復(fù)合成功。

1.4 顱骨缺損修復(fù)及分組

隨機(jī)選擇一側(cè)骨缺損作實(shí)驗(yàn)側(cè)，植入復(fù)合PRP 的ABM；另一側(cè)為對(duì)照側(cè)，僅植入ABM。逐層縫合切口。常規(guī)飲食， 術(shù)后3 d 每天40 萬(wàn)U 青霉素肌注。分別于術(shù)后2，4，8，12周取材，暴露顱骨，去除骨缺損處粘連的軟組織，在骨缺損周圍0.5cm正常骨質(zhì)處全層整塊取下顱頂骨，沖冼標(biāo)本，去除表面血污，放入4%多聚甲醛固定液中，4℃條件下固定24h。然后常規(guī)免疫組織化學(xué)染色，陰性對(duì)照：用PBS代替一抗工作液，重復(fù)以上操作。

1.6 VEGF表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果觀察

VEGF的陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)，呈淺黃色至棕黃色不等，隨著表達(dá)強(qiáng)度的增高顏色加深。陰性：細(xì)胞無(wú)著色，陽(yáng)性：細(xì)胞染成淡黃色，強(qiáng)陽(yáng)性：細(xì)胞染成棕黃色。表達(dá)細(xì)胞包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞等。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每側(cè)標(biāo)本隨機(jī)選取6張VEGF免疫組織化學(xué)切片，在顯微鏡下取40倍視野，將圖像采集入Image-proplus 5.0病理圖像分析系統(tǒng)，每張切片觀察5個(gè)視野，觀察不同時(shí)間點(diǎn)兩組骨缺損區(qū)域VEGF的表達(dá)強(qiáng)度情況。隨機(jī)測(cè)10個(gè)陽(yáng)性染色點(diǎn)灰度值，最后取平均灰度值，染色越深，灰度值越低。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組VEGF表達(dá)強(qiáng)度平均灰度值結(jié)果的對(duì)比采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，以p <0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 VEGF在骨缺損修復(fù)中的表達(dá)強(qiáng)度灰度值

Image-proplus 5.0病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量?jī)山MVEGF表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的VEGF表達(dá)均呈逐漸降低的趨勢(shì)。但實(shí)驗(yàn)組在2周至4周的時(shí)間區(qū)間內(nèi)VEGF表達(dá)呈急劇下降，4周至8周至12周，下降趨于平緩。對(duì)照組在2周和4周時(shí)均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。兩組VEGF表達(dá)強(qiáng)度在2周和4周的差異有顯著性（P <0.01） ，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在8周和12周差異無(wú)顯著性（P >0.05）。

3討論

3.1兔顱骨骨缺損模型的建立

兔的頭皮層較薄，顱骨易于顯露，制備骨缺損手術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行，術(shù)區(qū)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，相對(duì)安全。本實(shí)驗(yàn)參照多位學(xué)者成功的研究結(jié)果建立了兔顱骨骨缺損的模型，此種類型兔顱骨骨缺損，如果不加入干預(yù)因素，如植入移植材料等，不能達(dá)到自然愈合，最后只能以軟組織瘢痕充填缺損區(qū)域[4，5] 。有了以上研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)無(wú)需設(shè)計(jì)空白對(duì)照組。且本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物自身對(duì)照的設(shè)計(jì)方案，避免了由于動(dòng)物個(gè)體差異造成的偏倚，提高了不同干預(yù)方法之間進(jìn)行結(jié)果比較的可靠性。

3.2 采用的骨移植材料

目前，學(xué)者們公認(rèn)的認(rèn)為理想的骨充填材料應(yīng)具備以下條件 [6，7] ：（1） 無(wú)毒、不影響正常生長(zhǎng)發(fā)育等良好的生物相容性；（2）有一定的機(jī)械強(qiáng)度和良好的可塑性，（3）能夠降解；（4）有一定的孔隙率。脫細(xì)胞骨基質(zhì)（ABM）是對(duì)異體或異種動(dòng)物的骨骼通過(guò)一系列生物化學(xué)方法處理，去除了基質(zhì)中的細(xì)胞成分及間質(zhì)大分子蛋白，而保留了骨組織的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，其實(shí)質(zhì)是骨脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)，是天然生物骨衍生材料的一種。其結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，生物力學(xué)特性得以保留，具有天然的適合細(xì)胞、血管生長(zhǎng)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、合適的孔徑及孔隙率等[8]。

3.3 VEGF在修復(fù)骨缺損中的表達(dá)

傷口愈合和組織再生的基礎(chǔ)是血管的形成和生長(zhǎng) [9]。學(xué)者們研究表明，骨折修復(fù)過(guò)程中血管生成抑制可導(dǎo)致類似人類萎縮性骨不連的纖維組織形成[10]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF） 是最活躍的血管生長(zhǎng)因子， 它與血管內(nèi)皮上的特異性受體結(jié)合， 在促內(nèi)皮增殖和血管生成的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要和強(qiáng)大的作用。Mayr-Wohlfart等[11]等在體外培養(yǎng)人成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果成骨細(xì)胞的增殖能力提高了69%，這足以表明VEGF具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化增殖和成骨能力。還有學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)[12]，在骨折愈合的不同階段不同的組織細(xì)胞VEGF的都有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)， 而VEGF在正常骨組織內(nèi)則沒(méi)有表達(dá)。所以學(xué)者們一致認(rèn)為，VEGF 在骨折修復(fù)過(guò)程中不同的表達(dá)程度體現(xiàn)了血供重建不同時(shí)期。實(shí)驗(yàn)研究還表明，VEGF骨創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中在早期的血管生成階段、后期骨痂結(jié)構(gòu)形成、改建和礦化也有著高度活性表達(dá) [12]。。因此，可以說(shuō)VEGF 作為促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化的特異性細(xì)胞因子， 在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在骨缺損修復(fù)愈合的不同階段， VEGF 基因的表達(dá)程度也是不同的。實(shí)驗(yàn)組在第二周時(shí)表達(dá)細(xì)胞為成骨細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞VEGF的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與對(duì)照組相比具有顯著的差異性。然后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的VEGF表達(dá)均呈逐漸降低的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組2周后的各種細(xì)胞VEGF表達(dá)強(qiáng)度呈明顯降低，并逐漸趨于平緩。作者認(rèn)為其機(jī)理為：在實(shí)驗(yàn)初期階段，實(shí)驗(yàn)組PRP中含有大量的生長(zhǎng)因子，成骨細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等表現(xiàn)VEGF的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，具有迅速止血，減輕炎癥，促使血管的形成及骨修復(fù)作用；而對(duì)照組由于無(wú)復(fù)合PRP，其過(guò)程僅是由于骨缺損局部出血、炎性細(xì)胞反應(yīng)、血流中斷等創(chuàng)傷因素因素引起VEGF的表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度比實(shí)驗(yàn)組弱，并且會(huì)一直持續(xù)到術(shù)后第4周左右。根據(jù)各組組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)和VEGF的表達(dá)情況，可以認(rèn)為PRP促進(jìn)骨修復(fù)的作用發(fā)生在植入后7至14天內(nèi)。實(shí)驗(yàn)初期植入顆粒的嚴(yán)密包繞、形成大量的血管、伴以植入顆粒降解和炎癥迅速消退等原因，都是后期骨修復(fù)的基礎(chǔ)。

綜上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）促進(jìn)骨缺損修復(fù)的機(jī)制為： 第一，提供多種高濃度的生長(zhǎng)因子：PRP與ABM復(fù)合為骨缺損的早期修復(fù)提供高濃度的血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet derived growth factor PDGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β TGF-β）、VEGF、胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor IGF）等生長(zhǎng)因子[13～15]。這些生長(zhǎng)因子具有強(qiáng)大的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的能力。高濃度生長(zhǎng)因子是機(jī)體內(nèi)部自身修復(fù)系統(tǒng)的重要組成部分，所以它們能夠在植入骨缺損后迅速參與到機(jī)體的修復(fù)過(guò)程之中，有力地促進(jìn)了骨組織的早期愈合。 第二，形成成骨性修復(fù)的局部微環(huán)境。在本實(shí)驗(yàn)中，植入骨缺損ABM顆粒首先激活PRP，形成凝膠樣物質(zhì)，促使血小板釋放生長(zhǎng)因子。當(dāng)這種凝膠狀物質(zhì)復(fù)合ABM顆粒植入骨缺損處時(shí)，會(huì)使受植床中的細(xì)胞處于含有較多生長(zhǎng)因子的微環(huán)境中。凝膠狀的形態(tài)具有的生長(zhǎng)因子緩釋效應(yīng)，使血小板短期釋放的生長(zhǎng)因子能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)而穩(wěn)定地釋放該處的微環(huán)境中。PRP復(fù)合ABM顆粒啟動(dòng)了早期活躍的成骨活動(dòng)，有利于骨缺損的早期愈合和后期的成骨效果。

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