李醫(yī)等

【摘要】目的：為進一步縮短菌血癥實驗診斷報告時間，評價血培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定和藥敏試驗的可行性。方法：100例單一菌陽性血培養(yǎng)標(biāo)本，包括42例陽性球菌和58例陰性桿菌，進行直接法PhoenixTM 100儀器鑒定和藥敏試驗，與標(biāo)準(zhǔn)傳代培養(yǎng)法比較鑒定和藥敏的準(zhǔn)確率、符合率。結(jié)果：58株陰性桿菌中53株鑒定正確（準(zhǔn)確率91.4%），2株鑒定錯誤（3.4%），3株不能鑒定（5.2%）；42株陽性球菌中，26株鑒定正確（準(zhǔn)確率61.9%），12株鑒定錯誤（28.6%），4株不能鑒定（9.5%）。在藥敏試驗結(jié)果中，陽性球菌的藥敏試驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法比較，符合率達96.6%，其中極重大錯誤、重大錯誤、次要錯誤分別為0.3%、0.0%、3.2%；陰性桿菌試驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法比較，符合率達98.8%，其中極重大錯誤、重大錯誤、次要錯誤分別為0.1%、0.3%、0.8%。結(jié)論：單一革蘭陰性菌血培養(yǎng)標(biāo)本應(yīng)用自動化儀器PhoenixTM 100系統(tǒng)鑒定和藥敏試驗結(jié)果可靠，而單一革蘭陽性菌血培養(yǎng)標(biāo)本藥敏試驗結(jié)果可靠，但PhoenixTM 100直接鑒定準(zhǔn)確率較低（61.9%）。

【關(guān)鍵詞】血培養(yǎng)；細(xì)菌鑒定；藥敏試驗；PhoenixTM 100

【中圖分類號】TH773 【文獻標(biāo)識碼】B【文章編號】1004-4949（2014）03-0090-01

血流感染（Blood stream infections，BSI）及相關(guān)的敗血癥是臨床急癥，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是全球面臨的重要醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。流行病學(xué)研究資料表明，約2%的住院病人和高達75%的重癥監(jiān)護病人可發(fā)生敗血癥，死亡率高達20～50%。住院病人中，血培養(yǎng)陽性病人的死亡率是血培養(yǎng)培養(yǎng)陰性者的12倍。另據(jù)報道，從敗血癥休克發(fā)生直到開始靶向治療，每延誤1小時，敗血癥休克死亡的危險性約增加8%[1]。

因此，加快血流感染的診斷，進而及早進行有針對性的抗菌藥物治療，對于救治病人，降低死亡率有十分重要的意義。血培養(yǎng)檢查是診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而，盡管證據(jù)表明快速鑒定和有效的抗菌藥物治療能挽救病人的生命，但當(dāng)前，臨床微生物實驗室即使應(yīng)用先進的自動化血培養(yǎng)儀檢測陽性后，還需進行革蘭染色，傳代培養(yǎng)，生化試驗，再進行藥物敏感實驗，至少耗時2～3天，而對于一些苛養(yǎng)菌或非典型菌則耗時更長，不可避免錯失了救治的最佳機會。國內(nèi)外報道了很多直接從陽性血培養(yǎng)液用各種自動化儀器進行鑒定和藥敏試驗的方法，為積累經(jīng)驗，減少血培養(yǎng)報告周轉(zhuǎn)時間，我們對連續(xù)送檢的103例陽性血培養(yǎng)標(biāo)本進行了直接鑒定和藥敏試驗，現(xiàn)將結(jié)果報告如下：

材料與方法

一、樣本

103份革蘭染色表明是單一菌血癥的血培養(yǎng)標(biāo)本來自2013年2月至2013年5月間浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院的住院和門診病人，同一病人只計第一次陽性送檢樣本。其中傳代培養(yǎng)以后有兩種以上細(xì)菌生長的3例（2.9%）標(biāo)本，將其排除在外。剩下100例單一菌血癥血培養(yǎng)經(jīng)鑒定為陽性球菌的42例，陰性桿菌的58例。42例陽性球菌中以葡萄球菌為主（33株），包括金黃色葡萄球菌10株，

其他凝固酶陰性葡萄球菌23株；腸球菌屬5株；鏈球菌屬3株；微球菌屬1株。58株陰性桿菌中，腸桿菌科44株，包括大腸埃希菌16株，肺炎克雷伯菌占25株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株，奇異變形桿菌1株，產(chǎn)氣腸桿菌1株。非發(fā)酵菌14株，包括鮑曼不動桿菌9株，銅綠假單胞菌4株，嗜麥芽窄食假單胞菌1株。

二、主要儀器與試劑

美國BD公司BACTEC FX自動血培養(yǎng)儀及其配套BD需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶，PhoenixTM 100自動化細(xì)菌鑒定儀及其配套的陰性桿菌和陽性球菌的鑒定藥敏復(fù)合卡。

三、標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定和藥敏

將已取好病人血樣的血培養(yǎng)瓶置于BACTEC FX血培養(yǎng)儀中孵育，儀器陽性報警后，取少量陽性血培養(yǎng)瓶中的液體涂片革蘭染色，同時接種于血瓊脂平板，置37℃，5% CO2孵箱中孵育過夜，挑取單個菌落調(diào)整至0.5～0.6麥?zhǔn)蠞岫?，根?jù)細(xì)菌菌落的生長特征來區(qū)分是陽性菌還是陰性菌，分別選用陽性球菌或陰性桿菌鑒定藥敏卡用PhoenixTM 100自動化鑒定儀鑒定和藥敏。

四、PhoenixTM 100直接鑒定和藥敏

從陽性血培養(yǎng)瓶中抽取少量液體涂片革蘭染色，根據(jù)染色結(jié)果區(qū)分陽性菌和陰性菌。然后抽取6ml液體注入帶有分離膠的真空采血管中，3500rpm/min，離心5min后，細(xì)菌就沉降在分離膠的表面，用滅菌槍頭吸出上清液，留取0.1ml液體，輕輕混勻至底部細(xì)菌懸浮于液體中，將濃縮的菌液調(diào)至0.5～0.6麥?zhǔn)蠞岫?，之后的鑒定和藥敏過程參考標(biāo)準(zhǔn)方法。

五、數(shù)據(jù)分析

以標(biāo)準(zhǔn)方法為對照，根據(jù)是否正確鑒定至細(xì)菌種的水平，將直接法鑒定結(jié)果分為三類：正確鑒定，不能鑒定和錯誤鑒定；將藥敏不符的結(jié)果分為三類：極重大錯誤（標(biāo)準(zhǔn)法是R，直接法是S）、重大錯誤（標(biāo)準(zhǔn)法是S，直接法是R）、次要錯誤（標(biāo)準(zhǔn)法是I，直接法S/R；標(biāo)準(zhǔn)法是S/R，直接法是I）。

討論

菌血癥有較高的發(fā)病率和死亡率，早期給予病人合適的抗生素治療對于病人的生存是至關(guān)重要的，同時可以減少各種廣譜抗生素濫用給病人帶來的副作用并減輕病人的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，減少不必要的浪費。之前國內(nèi)外有較多陽性血培養(yǎng)用各種不同鑒定儀器直接鑒定和藥敏試驗的報道，我們與之前的研究結(jié)果都表明直接法的鑒定和藥敏試驗對于革蘭陰性桿菌有很高的符合率和準(zhǔn)確率，但對于陽性球菌的鑒定結(jié)果可信度不高[2]。有研究表明在用PhoenixTM 100鑒定前，在陽性血培養(yǎng)液內(nèi)加皂素后，直接法對革蘭陽性球菌的鑒定和藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法比較符合率可達82%和97%，大大提高了直接法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本次研究，只針對單一菌血癥的病人，所以陽性血培養(yǎng)涂片與革蘭染色非常重要，對血涂片結(jié)果是單一細(xì)菌，血瓊脂平板上生長多種細(xì)菌的病例也排除在外，以減少實驗誤差。本次研究也只針對革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌，對于血液中的酵母菌引起的單一菌血癥也排除在外。

對于鑒定錯誤的陽性球菌，我們發(fā)現(xiàn)大都被鑒定為片球菌屬和庫克菌屬，因此對于此類菌的鑒定結(jié)果，需借助其他補充試驗確認(rèn)。庫克菌是皮膚和口腔常居菌，很少引起菌血癥，有研究表明，表型變異可能是將葡萄球菌錯誤鑒定為庫克菌屬的原因。

盡管革蘭陽性球菌的鑒定準(zhǔn)確率較低，但其藥敏符合率卻高達96.6%，并且有12株（47.8%）菌株的藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法完全一致；陰性桿菌的藥敏符合率也高達98.8%，其中45株（77.6%）的藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法完全一致。本次實驗中，只有苯唑西林和四環(huán)素發(fā)生了極重大錯誤。重要的是，直接藥敏法（比標(biāo)準(zhǔn)法快24h）克服了常規(guī)方法用轉(zhuǎn)種的菌落做細(xì)菌鑒定和藥敏試驗費時的缺點，充分發(fā)揮了全自動血培養(yǎng)和全自動微生物鑒定儀的作用，可以及時為臨床提供較為準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果，使病人能夠早期合理運用抗生素，減少不必要的廣譜抗生素的使用，降低菌血癥病人的死亡率。

參考文獻

[1]Byran CS： Clinical implications of positive blood cultures. Clin Microbiol Rev 1989；2：329-53.

[2]Martin GS， Mannino DM， Eaton S， and Moss M. The epidemiology of sepsis in the US from 1979 through 2000. N Engl J Med .2003； 348：1546–1554.