王妲妲 陳曉蘭 王瑩 崔瀟婷

摘要 [目的]研究復(fù)方犬腸寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。[方法]采用薄層色譜（TLC）法對復(fù)方犬腸寧膠囊中的黃連、黃柏、白頭翁、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗堿的含量，研究復(fù)方犬腸寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。[結(jié)果]薄層色譜鑒別表明，樣品分離度好，斑點(diǎn)清晰，且陰性對照無干擾；鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在10.92～163.74 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=39 611X-2387.9（R2=0.999 8），平均加樣回收率為97.60%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.64%（n=6）。[結(jié)論]該標(biāo)準(zhǔn)操作簡便，專屬性、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于犬腸寧膠囊的質(zhì)量檢測方法。

關(guān)鍵詞 復(fù)方犬腸寧膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號(hào) S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05039-03

復(fù)方犬腸寧膠囊由黃連、黃柏、白頭翁、黃芪等十味中藥通過制顆粒填充法制備而成的膠囊制劑。處方中白頭翁性苦寒，歸脾胃大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止痢的作用，黃連和黃柏性苦寒，分別歸脾胃大腸和腎膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。通過臨床調(diào)查研究結(jié)果顯示，復(fù)方大腸寧膠囊主治犬濕熱瀉痢型腹瀉或病毒感染引起的胃腸炎等。為有效控制犬腸寧膠囊的質(zhì)量，筆者對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以建立有效的質(zhì)量控制方法，為復(fù)方白頭翁膠囊的安全用藥奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Waters2695/2996/Empower高效液相色譜系統(tǒng)、METTLER TOLEDO XS105電子天平；白頭翁皂苷B4（批號(hào)111766-200601）、黃芪甲苷對照品（批號(hào)110781 -200512）、鹽酸小檗堿對照品（批號(hào)110713-200609、含量98.1%）和黃連（批號(hào)111430）、黃柏（批號(hào)111520）對照藥材，均由中國藥品生物制品檢定所提供；復(fù)方白頭翁膠囊樣品（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院制藥廠，批號(hào)091102、091110、091121）、乙腈（HPLC）、硅膠G薄層板（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水，為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 薄層色譜（TLC）鑒別。

1.2.1.1 白頭翁的薄層鑒別。取本品內(nèi)容物2 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取白頭翁皂苷B4對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，吸取上述2種溶液各3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65∶ 35∶ 10）下層液為展開劑、展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘至斑點(diǎn)清晰。

1.2.1.2 黃連、黃柏的薄層鑒別。取本品內(nèi)容物0.5 g，加甲醇20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，吸取上述2種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶ 1∶ 2）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.1.3 黃芪的薄層鑒別。取本品內(nèi)容物10 g，加乙酸乙酯30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液棄去，濾渣揮干，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，加水30 ml使溶解，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，先用等體積的氨試液振搖洗滌，再用等體積的水振搖洗滌，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[1]，吸取供試品溶液5 μl、對照品溶液2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（65∶ 35∶ 10）下層溶液為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘約10 min，日光下檢視。

1.2.2 鹽酸小檗堿的含量檢測[1-4]。

1.2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。色譜柱為AQ.C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25∶ 75），檢測波長265 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量均為10 μl。在此色譜條件下，供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μl進(jìn)樣測定。

1.2.2.2 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備。取本品粉末約0.4 g，精密稱定，置25 ml量瓶中，加甲醇約20 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。按處方，同法制成不含黃連、黃柏的陰性樣品溶液。

1.2.2.3 線性關(guān)系考察。精密稱取在105 ℃干燥5 h的鹽酸小檗堿對照品5.26 mg置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0 ml置25 ml量瓶中，各加甲醇至刻度，搖勻，制得每1 ml含鹽酸小檗堿10.92、21.83、54.58、109.16、163.74 μg的溶液，在“1.2.2.1”色譜條件下，進(jìn)樣10 μl測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。

1.2.2.4 精密度試驗(yàn)。取上述同一對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，按照“1.2.2.1”色譜條件測定峰面積，考察其日內(nèi)精密度；取上述同一對照品溶液10 μl連續(xù)3 d，測定峰面積，考察其日間精密度。

1.2.2.5 加樣回收率試驗(yàn)。分別取已知含量的樣品5份，各精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，按“1.2.2.2”供試品溶液制備方法制備并測定，計(jì)算回收率。

1.2.3 樣品測定。精密稱取復(fù)方大腸寧膠囊不同批號(hào)的樣品各6份，按供試品溶液制備方法制備，在“1.2.2.1” 色譜條件下，進(jìn)行含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法鑒定結(jié)果

2.1.1 白頭翁的鑒別。由圖1可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照溶液則無此相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.1.2 黃連、黃柏的鑒別。由圖2可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照溶液則無此相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.1.3 黃芪的鑒別。由圖3可知，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照溶液則無此相應(yīng)斑點(diǎn)。

2.2 高效液相色譜法測定結(jié)果

2.2.1 鹽酸小檗堿的專屬性。從供試品色譜中（圖4）可以看出，鹽酸小檗堿色譜峰可達(dá)到基線分離與相鄰峰分離度>2，理論板數(shù)應(yīng)不低于9 598，且陰性樣品溶液不干擾測定。

2.2.2 鹽酸小檗堿的線性范圍。經(jīng)線性回歸分析（圖5），鹽酸小檗堿的回歸方程為Y=39 611X-2 387.9（R2=0.999 8），說明鹽酸小檗堿在10.92～163.74 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn)。精密度試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，連續(xù)測定3 d，測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.86%、0.74%、0.84%，表明樣品的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好。

2.2.4 回收率試驗(yàn)。在已知含量的5份樣品中各精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，按“1.2.2.2”供試品溶液制備方法制備，通過測定的峰面積，計(jì)算出處理后樣品含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5份樣品的平均回收率為97.60%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.64%（表2），該結(jié)果符合要求。

2.3 樣品測定 通過抽取復(fù)方犬腸寧膠囊3個(gè)批號(hào)（091102、091110、091121）的樣品各6份進(jìn)行含量測定，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，3個(gè)批號(hào)樣品鹽酸小檗堿含量分別為3.94、4.26、3.81，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.12%、1.35%、0.83%，根據(jù)以上樣品的測定結(jié)果，結(jié)合不同產(chǎn)地黃連、黃柏鹽酸小檗堿含量的差異及臨床研究結(jié)果的分析，暫定本品每粒含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計(jì)，不得少于1.2 mg。

3 討論

此處方中白頭翁、黃連和黃柏為君藥，發(fā)揮清熱解毒、涼血止痢的功效，經(jīng)前期研究白頭翁的有效成分白頭翁皂苷B4峰面積太小，達(dá)不到定量限的要求，不適于作為本品有效含量的檢測指標(biāo)，因此選擇以白頭翁皂苷的薄層作為定性指標(biāo)，黃連和黃柏的有效成分鹽酸小檗堿作為含量指標(biāo)，能夠比較客觀地評價(jià)藥物的可控性、有效性和安全性。

鹽酸小檗堿的含量檢測，筆者曾考察提取方法（超聲、回流、浸漬）、提取時(shí)間（30、40、50 min），以回流、聲提取方法提取的鹽酸小檗堿含量較高，但兩者含量相差不大，從操作簡便角度考慮，確定提取方法為超聲提取，提取時(shí)間為30 min；另比較提取溶劑鹽酸-甲醇（1∶ 100）和甲醇，兩者含量相差不大，考慮到鹵素離子對色譜柱的傷害，確定提取溶劑為甲醇；曾采用乙腈-0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液（35∶ 65）為流動(dòng)相，但鹽酸小檗堿峰與相鄰雜質(zhì)峰未達(dá)到基線分離，并有拖尾現(xiàn)象。使用文中流動(dòng)相，結(jié)果達(dá)到基線分離，峰形較好。經(jīng)過精密度考察、穩(wěn)定性考察等試驗(yàn)，該方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性良好，列入本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。

根據(jù)以上樣品的測定，以及不同產(chǎn)地黃連、黃柏鹽酸小檗堿含量的差異暫定本品每粒含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿（C20H18ClNO4）計(jì)，不得少于1.2 mg。

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責(zé)任編輯 黃小燕 責(zé)任校對 況玲玲