唐曉麗

【摘 要】呼吸道感染是兒科最常見的疾病，病毒是引起呼吸道感染最常見的病原 [1]。常見的呼吸道病毒有呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒和腺病毒等。近年來新的致病性病毒也不斷地被發(fā)現(xiàn)，如人類偏肺病毒、人博卡病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等。部分病毒傳染性強(qiáng)，傳播速度快，潛伏期短，臨床表現(xiàn)類似，兒科醫(yī)生無法依據(jù)病情準(zhǔn)確判斷病原，給臨床診斷及治療帶來極大困難。精確的病原學(xué)分析不僅是臨床確診依據(jù)，也對(duì)控制傳播途徑、采取預(yù)防措施及合理選擇治療方案非常重要。因此，臨床開展準(zhǔn)確、快速呼吸道病毒檢測(cè)已成為兒童呼吸道感染中的重要診斷手段，而基于PCR技術(shù)的分子診斷方法就成為呼吸道病毒檢測(cè)的新標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】呼吸道病毒；病毒檢測(cè)；分子診斷方法

呼吸道病毒感染傳統(tǒng)的診斷方法為病毒分離培養(yǎng)及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。病毒分離培養(yǎng)是確診病毒及發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術(shù)手段，但培養(yǎng)及鑒定過程繁瑣，費(fèi)時(shí)，診斷效率低，臨床開展有一定困難。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子診斷方法已成為呼吸道病毒檢測(cè)的新標(biāo)準(zhǔn)。本文就目前呼吸道病毒核酸檢測(cè)的研究進(jìn)展作一總結(jié)論述。

1 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)可在一次反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)和鑒別多種病原體，在混合感染的鑒別診斷上具有很高的實(shí)用價(jià)值。因其快速、簡(jiǎn)便和高通量等特點(diǎn)，目前多重PCR技術(shù)在呼吸道病毒的檢測(cè)中已得到了廣泛應(yīng)用。近年出現(xiàn)了一些自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單的檢測(cè)平臺(tái)，如Seeplex TMRV和Labopass TMRV檢測(cè)試劑盒。Seeplex TMRV試劑盒在保證高度特異性的同時(shí)，具有更大范圍的退火適宜溫度，Seeplex TMRV-12試劑盒則能夠同時(shí)檢測(cè)12種呼吸道病毒。

2 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)的積累，對(duì)常規(guī)PCR過程進(jìn)行可視化的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。近年來多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)已成為呼吸道病毒檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。該方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、實(shí)時(shí)定量等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。運(yùn)用多重?zé)晒舛縋CR方法可成功地對(duì)流感病毒進(jìn)行分型，也可同時(shí)檢測(cè)副流感病毒、冠狀病毒和呼吸道合胞病毒等多種呼吸道病毒。Sung等應(yīng)用多重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)急性呼吸道感染住院患兒呼吸道標(biāo)本中的病毒，總陽(yáng)性率為47%，是病毒培養(yǎng)等常規(guī)方法檢出率的2倍。Chen[2]等用該方法檢測(cè)流感病毒和呼吸道合胞病毒，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)靈敏度和特異度分別為99%和100%。但PCR方法不能區(qū)別有毒力的病毒和死病毒，因此目前尚不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAmP）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是利用6條特異性引物與靶基因的6個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行退火雜交和等溫?cái)U(kuò)增。該方法不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)及紫外線觀察等過程，因此具有簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)。利用LAMP技術(shù)，還可對(duì)甲型流感H1到H3亞型進(jìn)行分型。因該技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，故特別適合基層單位進(jìn)行病原微生物的快速檢測(cè)。

4 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）

依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，是由一對(duì)帶有T7啟動(dòng)子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫的核酸擴(kuò)增技術(shù)?？稍?h內(nèi)將模板RNA擴(kuò)增109倍，比常規(guī)PCR高1000倍，因此具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。

5 基因芯片

基因芯片又稱基因微陣列，是指將大量靶基因片段固定在經(jīng)過修飾的載體上，與標(biāo)記的核酸樣品進(jìn)行雜交，經(jīng)信號(hào)處理系統(tǒng)分析雜交信號(hào)，獲取樣品檢測(cè)結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、快速檢測(cè)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種病毒的檢測(cè)。利用基因芯片技術(shù)，可通過一次檢測(cè)獲取所有病毒信息，包括發(fā)現(xiàn)新病毒或變異株。丁麗新[3]等采用基因芯片對(duì)180例發(fā)病初期的呼吸道感染病人的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果表明采用基因芯片技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)直接從病人的咽拭子標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)8種呼吸道病原體。Chiu等建立的病毒芯片可同時(shí)檢測(cè)7種呼吸道病毒，檢出效率較免疫熒光法提高了19%，與特異性PCR擴(kuò)增檢測(cè)方法相當(dāng)。但基因芯片的不足之處在于費(fèi)用高，研制周期長(zhǎng)，在臨床廣泛應(yīng)用有一定困難。

6 深度測(cè)序技術(shù)

2005年底，454公司推出了基于焦磷酸測(cè)序法的高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)。與傳統(tǒng)測(cè)序相比，該方法的主要特點(diǎn)是能在極短時(shí)間內(nèi)對(duì)生物樣品基因組進(jìn)行分析，可在未知基因組信息的情況下用于直接病毒檢測(cè)，有助于檢測(cè)未知病毒和病毒突變株。Yongfeng H[ 4 ]等采用該技術(shù)對(duì)4位病人咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，在48小時(shí)內(nèi)獲得了超過590000個(gè)序列，涵蓋了幾乎全部細(xì)菌、真菌、病毒等核酸信息，此外，甲型流感病毒被特異性檢出。但測(cè)序檢測(cè)到的病毒序列不足以建立疾病的因果關(guān)系，因此在臨床應(yīng)用中還需結(jié)合病毒培養(yǎng)及血清學(xué)方法共同分析。

7 自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)

隨著分子診斷方法的日益完善，呼吸道病毒的商品化檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)相繼問世。FDA于2008年批準(zhǔn)可同時(shí)檢測(cè)和鑒定l2種特殊呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒檢測(cè)板在美國(guó)上市。xTAG可同時(shí)檢測(cè)和區(qū)別A型流感病毒H1和H3亞型，也可檢測(cè)2001年才被人類認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)的人類偏肺病毒。該試劑盒在2009年流感大流行期間發(fā)揮了重要的監(jiān)測(cè)作用。目前最新的xTAG試劑盒可在3.5h內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多達(dá)20種病毒及其亞型。ProFlu+是另一種FDA批準(zhǔn)的病毒即時(shí)檢測(cè)法，該方法可在3h內(nèi)完成4種常見呼吸道病毒（A型和B型流感病毒及A型和B型呼吸道合胞病毒）的檢測(cè)。

BD Max系統(tǒng)是美國(guó)BD公司研發(fā)的全自動(dòng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了全自動(dòng)核酸提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，擴(kuò)增反應(yīng)在3h內(nèi)完成。研究顯示該技術(shù)對(duì)流感病毒和RSV的檢測(cè)靈敏度和特異度均達(dá)到較高水平。Idaho Technologies公司研發(fā)的FilmArray分子診斷平臺(tái)能在1小時(shí)內(nèi)完成從核酸提取到數(shù)據(jù)分析過程，目前該平臺(tái)能檢測(cè)15種常見的呼吸道病毒[5]。

這些自動(dòng)化的操作系統(tǒng)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，能明顯縮短檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，同時(shí)避免了實(shí)驗(yàn)操作中的人為因素誤差，使得檢測(cè)結(jié)果更加均一，是今后病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向所在。

8 小結(jié)

呼吸道病毒是呼吸道感染的主要病原，多種病毒的協(xié)同感染、病毒的變異和新病毒的出現(xiàn)給人們認(rèn)識(shí)和防控病毒感染帶來巨大挑戰(zhàn)。在臨床工作中，對(duì)呼吸道感染病人進(jìn)行病毒病原的檢測(cè)能為疾病的臨床診斷和治療提供可靠的病原學(xué)依據(jù)，防止抗菌藥物濫用。此外，長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)特定地區(qū)病毒的流行季節(jié)、易感人群及臨床表現(xiàn)對(duì)疾病的預(yù)防、流行病學(xué)研究及疫苗的研制均有重要意義。因此了解和掌握呼吸道病毒檢測(cè)新技術(shù)、新方法對(duì)疾病的診斷、治療和疫情的防控非常重要。由于核酸檢測(cè)方法的靈敏度、特異性都較傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光等方法顯著提高，目前已成為各實(shí)驗(yàn)室主要檢測(cè)技術(shù)。有研究顯示，多重PCR檢測(cè)呼吸道病毒是最節(jié)約成本的檢測(cè)手段，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能提供病毒載量的定量信息，有助于進(jìn)一步研究病毒與臨床表現(xiàn)關(guān)系，高通量的檢測(cè)方法及宏基因組技術(shù)是目前的發(fā)展趨勢(shì)，而新型核酸擴(kuò)增技術(shù)如NASBA也有很好的發(fā)展前景。近年來，分子診斷技術(shù)自動(dòng)化程度不斷提高，商品化的自動(dòng)檢測(cè)技術(shù)大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，使其更加符合臨床需要。在臨床工作中，我們可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皩?shí)驗(yàn)條件選擇檢測(cè)技術(shù)，為呼吸道感染的病毒病原學(xué)診斷提供可靠依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Mathony J B.Detection of respiratory viruses by molecular methpds[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：716-747.

[2]Chen Y，Perez J W，Vargis e A，et al .Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immune-polymerase chain reaction[J]. Anal Biochem，2011，26（2）：124-126.

[3]丁麗新，吳疆，林長(zhǎng)纓.基因芯片技術(shù)在常見呼吸道病毒感染早期診斷上的應(yīng)用[J].國(guó)際病毒學(xué)雜志，2007，14（4）：105-107.

[4]Yongfeng H， Fan Y， Jie D， et al. Direct pathogen detection from swab samples using a new high throughput sequencing technology[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（2）：241-244.

[5]Poritz M A，Blaschke A J，Byington C L，et al.FilmArray，an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection：development and application to respiratory tract infection[J]. Plos One，2011，6（10）：e26047.