徐靖 王效寧 韓義勝 熊懷陽 嚴小微

干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫嚴重影響植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量。在長期的進化過程中植物已在分子、細胞和系統(tǒng)水平上進化出了一套復雜的調(diào)控機制來感受并響應各種外界刺激，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游基因的表達來應答環(huán)境變化是這一調(diào)控機制的重要環(huán)節(jié)。AP2/ERF（apetala2/ethy-lene response factor）家族轉(zhuǎn)錄因子含有60～70個氨基酸組成的高度保守AP2結(jié)合域，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，通過調(diào)節(jié)下游基因的表達廣泛參與植物的生長發(fā)育、激素應答及對生物和非生物脅迫的響應。目前AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥、水稻、玉米、大豆、西紅柿、黃瓜等多種植物中得到鑒定。根據(jù)DNA結(jié)合元件的不同，可將AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子分為AP2、ERF、DREB（dehydration-responsive element-binding protein）和RAV（related to ABI3/VPl）4個亞家族，ERF家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大家族的一個主要亞家族，在調(diào)節(jié)植物對生物和非生物逆境反應中發(fā)揮重要作用。

普通野生稻（Oryza rufipogon， Griff）是亞洲栽培稻的祖先，能夠長期生長在各種惡劣的自然條件下，具有很強的抗逆特性，是水稻抗逆育種重要的遺傳資源。海南普通野生稻最原始，遺傳多樣性最高，具有很高的開發(fā)利用價值。在先前的研究中，篩選獲得一批抗逆性較強的海南普通野生稻材料，能夠長期在干旱、低溫和貧瘠等條件下健康生長。為了進一步了解海南普通野生稻的抗旱機理，對干旱條件下差異表達基因進行了分析，并篩選獲得了一個編碼AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的基因片段（結(jié)果未顯示），本文在此基礎上對該基因進行克隆和表達分析，為揭示該基因的功能奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

將收集的普通野生稻（Oryza rufipogon Griff）種子置于50℃烘箱中干燥48h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10min，清水沖洗4～5次。置于人工氣候箱培養(yǎng)，使用國際水稻所營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每5d換一次培養(yǎng)液，長至5葉期時于20%PFG條件下進行模擬干旱處理。150mmol/L NaCl條件下進行鹽脅迫處理，4℃光照培養(yǎng)箱中進行低溫處理，分別在處理0、2、4、6、12、24、48h取樣，用液氮磨成干粉狀，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2OrERF1基因和啟動子的克隆

根據(jù)先前篩選獲得的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因片段，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到與它最相似基因的CDNA序列，設計特異引物OsERFIF：5'一AGCGGTCCATGTGCTGTACCGGCGA-3'和OsE-RF1R：5'-TAGGGTTAATCACGATGTGATCCTG一3'。根據(jù)OrERFl在水稻基因組中最相似基因的啟動子序列設計特異性引物POsERFIF：5'-AACGCACATATGTTCATTGCCTAA一3'和POsE-RF1R：5'-GCCACCTCGTCGCCGGTACAGCACA-T-3'，分別以海南普通野生稻cDNA和基因組DNA為模板，對OrERF1的cDNA序列和啟動子序列進行擴增。PCR擴增反應：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收和純化后，與pMD-18T Cloning Kit （TAKARA公司）連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至DH5a感受態(tài)細胞，通過PCR檢測確定陽性克隆，送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.3生物學信息學分析

用ORF finder分析OrERFl cDNA序列的開放閱讀框，蛋白質(zhì)序列分析在http：//www.expasy.org網(wǎng)站相關(guān)軟件完成：通過BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與GenBank中登記的序列進行同源性比較，用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用啟動子順式作用元件預測網(wǎng)站PLACE軟件（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）對OrERF1啟動子序列進行分析。

1.4OrERF1的表達分析

采用北京康為世紀生物科技有限公司的SYBR green RT-PCR one step kit及Mx3005PPCR儀進行基因表達水平檢測。目的基因引物為QOrERFIF：5'-CTCAGTACGCGAGGTTCTTG-3'和QOrERFIR：5'-GAAGCTGTAGAGCACJTGTA-GTG-3'；內(nèi)參引物為18S，其引物為18S F：5'一CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3'和18S R：5'-CG-AACACTTCACCGGATCATT-3'。PCR程序為95℃預變性30s，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)；按默認程序繪制55℃至95℃融解曲線，不同處理條件下Oh的樣品設為Calibrator進行相對表達定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1OrERFl的克隆和分子特征

根據(jù)OrERF1在水稻基因組中的相似序列設計特異引物，以海南普通野生稻cDNA為模板進行PCR擴增，獲得一個1044bp的基因序列，包含一個1014bp的完整閱讀框，編碼337個氨基酸。OrERF1基因編碼氨基酸的相對分子質(zhì)量為34.70kD，理論等電點為5.30。

生物信息學分析表明OrERFl具有典型的植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征，包含一個由63個氨基酸組成的AP2保守結(jié)構(gòu)域（劃線處）（圖1）。OrERFl與秈稻中所對應的蛋白同源性為98.53%，涉及3個氨基酸的變異，1個氨基酸的缺失；與粳稻所對應的蛋白同源性為98.82%，涉及1個氨基酸的變異，3個氨基酸的插入；與大麥（Hordeum， vulgare）、玉米（Zea mays）和橙子（Citrussinensis）中的相應蛋白的同源性分別為50.71%、50.56%和39.89%。

2.2蛋白序列系統(tǒng)進化分析

AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)DNA結(jié)合域的特點可分為AP2、ERF、DREB和RAV 4個亞家族，為了進一步確定OrERFl與AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子之間的進化關(guān)系，選取了水稻中不同亞家族AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子與OrERFl進行同源比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.結(jié)果顯示水稻AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子分為4個分支，OrERFl與ERF亞家族聚為一類（圖2），說明OrERFl是ERF類轉(zhuǎn)錄因子。

2.3OrERF1啟動子的克隆和序列分析

根據(jù)OrERF1在水稻基因組中最相似基因的啟動子序列設計特異性引物，以海南普通野生稻基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得OrERFl基因翻譯起始密碼子ATG上游1358bp的啟動子區(qū)域。對OrERF1啟動子序列進行預測分析發(fā)現(xiàn)，該序列具有真核生物典型啟動子結(jié)構(gòu)特征，核心啟動子區(qū)位于ATG上游-112～-52bp，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點位于翻譯起始位點上游-61bp處；OrERF1啟動子區(qū)還含有眾多應答激素和脅迫信號元件，如茉莉酸應答元件CGTCA-motif、水楊酸應答元件TCA-element、真菌應答元件Box-Wl、厭氧應答元件ARE （anaerobic response ele-ment）、鹽誘導元件GT-1 motif、低溫應答元件LTR （low temperature responsive）和干旱應答相關(guān)元件MBS和ACGTATERD1等（圖3）。

2.4OrERF1表達分析

利用實時熒光定量PCR檢測了OrREFl在模擬干旱（PEG）、鹽（NaCl）和低溫（LT）等逆境條件下的表達特征。結(jié)果顯示，3種處理均能顯著上調(diào)OrREFl的表達。在PEG和NaCl處理后，OrREF1具有類似的表達特征，早期變化并不明顯，在處理12h后顯著增加，達到最大值；OrREFl對低溫比較敏感，處理后2h OrREF1的表達量就顯著上調(diào)，12h時達到最大值，48h時仍維持較高水平（圖4）。

3討論

大量的研究表明ERF蛋白在抵御病原體侵害的防御響應中具有重要的功能，過表達ERF基因能夠誘導下游PR相關(guān)基因的表達，增強植株對病原體的抗性。近年來研究表明，ERF蛋白不僅在病原防御響應中起重要作用，在激素和非生物脅迫響應中也具有重要的功能。例如，大豆GmERF3和GmERF7受干旱、高鹽和低溫等多種非生物脅迫的誘導，過表達后能夠提高煙草的抗鹽性、抗旱性和抗病性；水稻OsDERFl受干旱、乙烯和脫落酸調(diào)節(jié)，過表達后能顯著減低水稻對干旱的耐受性。雖然大量的ERF基因在不同植物中得到克隆，但只有少部分ERF基因在非生物響應中的功能得到鑒定。

普通野生稻蘊藏著豐富的抗逆基因，是水稻抗逆育種的重要遺傳資源。普通野生水稻馴化成栽培稻的過程中，一些基因會發(fā)生變異甚至丟失，這可能是普通野生水稻具有更強的抗逆性的原因。本研究在海南普通野生稻中篩選獲得一個受干旱誘導表達的ERF類轉(zhuǎn)錄因子OrERF1，編碼的蛋白有337個氨基酸組成，該基因在栽培稻的同源基因是一個未知功能基因，與栽培稻中的同源蛋白有4個氨基酸的差異。初步確定該基因是一個多逆境應答基因，OrERF1除了受干旱誘導外，也能對低溫和鹽脅迫做出響應。

植物基因啟動子含有多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上通過與轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)調(diào)作用，參與調(diào)控下游基因的表達，從而使植物能夠?qū)Ω鞣N生物和非生物脅迫做出響應。OrERFl啟動子區(qū)含有真菌應答元件Box-W、厭氧應答元件ARE、低溫應答元件LTR和干旱應答元件MBS等生物和非生物脅迫元件。這進一步說明OrERFl在野生稻的逆境脅迫響應中扮演重要角色。下一步將構(gòu)建OrERFl的植物表達載體，通過轉(zhuǎn)化水稻和擬南芥對其功能做進一步的驗證。