李凌彥 胡彬彬 趙吉然 魏云林 林連兵 季秀玲 張琦

摘要：以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為報(bào)告基因，將質(zhì)粒pRH2304轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母YM25235進(jìn)行表達(dá)分析，熒光顯微觀察結(jié)果表明GFP在YM25235獲得表達(dá)，建立了紅冬孢酵母YM25235遺傳轉(zhuǎn)化方法 在此基礎(chǔ)上，以高山被孢霉△6一脂肪酸脫氫酶基因取代pRH2304中的GFP基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRH2304MAD6，將其轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母YM25235進(jìn)行表達(dá)分析。PCR結(jié)果表明，高山被孢霉△6一脂肪酸脫氫酶基因已經(jīng)整合到Y(jié)M25235基因組中，進(jìn)一步的脂肪酸氣相色譜分析結(jié)果表明，該基因編碼產(chǎn)物催化n-6途徑中的亞油酸轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸，占細(xì)胞總脂肪酸的4.35%，但沒有檢測(cè)到催化n-3途徑中的α-亞麻酸轉(zhuǎn)化成十八碳四烯酸。

關(guān)鍵詞：紅冬孢酵母；高山被孢霉；△6一脂肪酸脫氫酶基因；γ一亞麻酸；表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-7847（2014）04-0304-06

多不飽和脂肪酸（polyunsaturdted fatty acids，PUFAs）是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵、碳原子數(shù)為18～22的直鏈脂肪酸，除了作為結(jié)構(gòu)成分和信號(hào)分子對(duì)維持細(xì)胞膜正常功能和一些基本的細(xì)胞過程具有重要的調(diào)節(jié)作用外，PUFAs在人體內(nèi)合成變化會(huì)導(dǎo)致多種疾病，比如心血管疾病、肥胖、非胰島素依賴性糖尿病、高血壓、神經(jīng)性疾病和癌癥等。PUFAs按照脂肪鏈甲基端引入的最后一個(gè)雙鍵位置分為n-3和n-6兩大類，亞油酸LA（linoleic acid C18：2，n一6）和α-亞麻酸ALA（α-Linolenic acid， 18：3 n-3）是n-6和n-3 PUFAs合成的前體，兩者在不同脂肪酸脫氫酶（Desaturase）和延長酶（Elongase）的交替催化下分別轉(zhuǎn)化成γ-亞麻酸GLA（γ一Linolenic acid， C18：3 n-6）、花生四烯酸AA （Arachidonic acid， C20：4 n-6）、EPA（Eicosatetraenoic acid， C20：4 n一3）和DHA （docosa-hexaenoic acid， C22：6 n-3）等多種PUFAS。同一種脫氫酶或者延長酶都可利用n-3和n-6途徑中的脂肪酸作為底物進(jìn)行催化，但是由于酶的底物偏好性特點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致一條途徑的脂肪酸轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，而另一條途徑的脂肪酸轉(zhuǎn)化減弱。

某些微生物產(chǎn)生并儲(chǔ)存的油脂占其生物總量的20%以上，最高可達(dá)細(xì)胞干重的80%，這類微生物稱為產(chǎn)油微生物。目前已報(bào)道的產(chǎn)油酵母包括耶羅維啞酵母屬（Yarrowia）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporid-ium）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、毛孢子菌屬（Tri-chosporon）和油脂酵母屬（Lipomyces）等一些種類，這些產(chǎn)油酵母油脂中富含PUFAs，而且油脂成分與常見的植物油相類似，因此可作為生活中植物食用油的替代品，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值，但是不含GLA。GLA是一種人體必須脂肪酸，是合成AA的前體，屬于n-6類PUFAs，AA可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成前列腺素、白細(xì)胞三烯以及脂氧合酶或是環(huán)氧合酶的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、減肥、抑制過敏、增強(qiáng)胰島素和抗血栓性心血管疾病等方面具有重要的生理功能，但是現(xiàn)有GLA商業(yè)來源難以滿足日益增長的市場(chǎng)需求，借助于基因工程手段構(gòu)建產(chǎn)高GLA菌株可作為潛在的替代來源之一。本研究將高山被孢霉（Mortierella alpina）△6-脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)油酵母——紅冬孢酵母（Rhodosporidium， Kra-tochvilovae）YM25235中進(jìn)行表達(dá)，使其產(chǎn)GLA，類似的研究在紅冬孢酵母屬中未見報(bào)道。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件

紅冬孢酵母（Rhodosporidium Kratochvilovae）菌株YM25235由昆明理工大學(xué)嗜極微生物研究室保存，質(zhì)粒pRH2304（圖1）購自新加坡民族大學(xué)，具有高山被孢霉（Mortierella alpina）△6一脂肪酸脫氫酶基因（MAD6，GenBank： AF307940）的T載體pTMAD6由南開大學(xué)李明春教授惠贈(zèng)；菌株YM25235在YM培養(yǎng)基（酵母膏0.3%、胰蛋白胨0.5%、麥芽糖0.5%，pH自然）中30℃條件下培養(yǎng)。

1.1.2主要試劑

酵母總DNA提取試劑盒為上海生工產(chǎn)品DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和DNA膠回收試劑盒購自大連寶生物工程公司，潮霉素以及油脂分析所用的油酸、亞油酸、γ-亞麻酸和α-亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國Sigma公司。

1.2紅冬孢酵母YM25235感受態(tài)細(xì)胞制備

挑取YM25235單菌落接種于5mL YM液體培養(yǎng)基中，150r/min、30℃培養(yǎng)過夜，以1%接種量轉(zhuǎn)接到100mL YM液體培養(yǎng)基中，150r/min、30℃培養(yǎng)至OD=1.3～1.5，4℃、5000r/min離心10min收集菌體，用100mL預(yù)冷的無菌水洗滌菌體兩次，然后用20mL lmol/L預(yù)冷的山梨醇洗滌1次，最后懸浮于200μL lmoI/L預(yù)冷的山梨醇中待用。

1.3pRH2304質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

取5μg pRH2304，通過電擊法轉(zhuǎn)化80μL制備的感受態(tài)YM25235，然后涂布于含400mg/L潮霉素的YM固體抗性平板上并置于30℃培養(yǎng)直至陽性克隆出現(xiàn)，最后通過熒光顯微鏡用油鏡觀察RtGFP基因是否在YM25235細(xì)胞中表達(dá)。

1.4pRH2304MAD6重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

參考已報(bào)道MAD6基因序列，設(shè)計(jì)合成引物對(duì)：MAD6F：5'-CATACCATGGCTGCTGC TC-CCAGTGTGA-3'（下劃線為BamH I位點(diǎn)）和MAD6R：5'-CTCGATATCTTACTGTG CCTTGCC-CATC-3'（下劃線為EcoR V位點(diǎn)），以含有MAD6基因的T載體作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min（30個(gè)循環(huán)）；72℃再延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用BamH I/EcoR V進(jìn)行酶切并回收酶切產(chǎn)物，同時(shí)用BamH I/EcoR V酶切pRH2304并回收大片段，用T4連接酶將兩種回收產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，由此獲得重組質(zhì)粒為pRH2304MAD6，MAD6基因取代原來GFP（green fluorescent protein）基因，所得質(zhì)粒經(jīng)酶切分析和測(cè)序，驗(yàn)證其正確性。

1.5pRH2304MAD6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

按1.2中的方法將重組質(zhì)粒pRH2304MAD6轉(zhuǎn)化感受態(tài)YM25235，涂布于含400mg/L的YM固體抗性平板上培養(yǎng)，挑取抗性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，用引物對(duì)MAD6F和MAD6R陽性克隆的篩選，同時(shí)用引物對(duì)RKD12F：5'-ATGGCCGCTAC CCTCCGCCAGC-3'和RKD12R：5'-CTAGAGTCCCTCGACGCCCGAG-T-3'來擴(kuò)增YM25235 △12-脂肪酸脫氫酶基因組序列來證明所獲得的陽性克隆為YM25235菌株。

1.6脂肪酸分析

將轉(zhuǎn)基因酵母種子液接種于50mL YM液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150r/min培養(yǎng)48h。離心收集酵母細(xì)胞，50℃，烘干后研磨，取100mg干菌粉加入5mL 5%的KOH-CH30H溶液中，70℃反應(yīng)3～5h。冷卻到室溫后，用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值為2.0，加入4mL 14% BF3（BF3/乙醚）-CH3OH溶液，70℃繼續(xù)反應(yīng)1.5h，合成脂肪酸甲酯。再加入飽和的NaCl溶液10mL，充分混勻后轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。用8mL l：4的氯仿：環(huán)己烷抽提兩次，合并提取液，然后加入適量無水Na2S208干燥提取液，靜置1h，過濾去除Na2S2O8，用氮?dú)鈱⒑兄舅峒柞サ臑V液吹干，正己烷回溶后通過氣相色譜（GC）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因紅冬孢酵母YM25235脂肪酸含量的變化。

2結(jié)果

2.1紅冬孢酵母YM25235質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系的建立

將pRH2304通過電擊法轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母YM25235，通過熒光顯微鏡檢測(cè)具有潮霉素抗性的阻性克隆，結(jié)果顯示pRH2304質(zhì)粒中的RtGFP基因在YM25235中獲得表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖2B），表明pRH2304可以轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母YM25235并使目的基因獲得表達(dá)，為下一步高山被孢霉MAD6基因的表達(dá)鑒定了基礎(chǔ)。

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pRH2304MAD6的構(gòu)建

通過PCR、酶切和連接方法，將MAD6基因序列插入pRH2304啟動(dòng)子PRtgpd和終止序列35T之間，取代原來的RtGFP基因序列，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pRH2304MAD6（圖3A）。用BamH I/EcoR V對(duì)pRH2304MAD6進(jìn)行雙酶切結(jié)果顯示，小片段與MAD6基因的PCR產(chǎn)物大小一致（圖3B，箭頭所示），而大片段約為11kb，大小與預(yù)期相符，說明質(zhì)粒構(gòu)建正確，進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果也證明這一點(diǎn)。

2.3紅冬孢酵母YM25235轉(zhuǎn)化子的鑒定

將重組質(zhì)粒pRH2304MAD6通過電擊法轉(zhuǎn)化紅冬孢酵母YM25235，提取潮霉素抗性的克隆子基因組DNA，用引物對(duì)RKD12F和RKD12R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，從抗性克隆子基因組DNA中也能擴(kuò)增出1.6kb的△12-脂肪酸脫氫酶基因組序列（圖4A），說明該克隆子為紅冬孢酵母。進(jìn)一步用引物對(duì)MAD6F和MAD6F進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示抗性克隆子基因組DNA中能擴(kuò)增出1.4kb的MAD6基因的序列（圖4B），表明pRH2304MAD6已經(jīng)轉(zhuǎn)化到Y(jié)M25235中并已整合到其基因組中。

2.4紅冬孢酵母YM25235陽性轉(zhuǎn)化子的脂肪酸分析

將重組質(zhì)粒pRH2304MAD6轉(zhuǎn)化YM25235，經(jīng)驗(yàn)證正確后提取轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的總脂肪酸進(jìn)行GC分析。如圖5所示，以pRH2304轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞作為對(duì)照，只有轉(zhuǎn)化了MAD6基因的酵母YM25235中產(chǎn)生保留時(shí)間為15.13min的新的特殊峰（圖5B，黑色箭頭所示），該峰保留時(shí)間與GLA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的一致，表明合成了新的GLA，其合成量占細(xì)胞總脂肪酸的4.35%（表1）。

3討論

△6-脂肪酸脫氫酶能同時(shí)催化n-6和n-3途徑中底物L(fēng)A和ALA生成GLA和OTA，但是一些研究表明該酶對(duì)n-6和n-3途徑中的底物具有偏好，比如苔蘚（Ceratodon purpureus）△6-脂肪酸脫氫酶對(duì)n-6途徑中底物L(fēng)A具有很強(qiáng)的偏好，而櫻草（Primula vialii）和少根根霉（Rhizopus ar-thizus）的△6-脂肪酸脫氫酶卻偏好n-3途徑中的ALA。紅冬孢酵母YM23235自身能合成LA和ALA，兩者均可作為△6一脂肪酸脫氫酶的潛在底物，但是從我們的分析結(jié)果看出，高山被孢霉△6-脂肪酸脫氫酶轉(zhuǎn)化的酵母油脂中只合成了GLA，沒有檢測(cè)到OTA，可以說明高山被孢霉△6-脂肪酸脫氫酶對(duì)n-6途徑中底物L(fēng)A具有很強(qiáng)的偏好。目前，除了少根根霉（Rhizopus arrhizus）的△6-脂肪酸脫氫酶外，未見絲狀真菌△6一脂肪酸脫氫酶偏好n一3途中的ALA作為底物合成OTA的研究報(bào)道。

人體中△6-脂肪酸脫氫酶可將外源性攝人的LA轉(zhuǎn)化成GLA并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成AA等其他n-6類PUFAs，來滿足機(jī)體的各種需要，然而老齡化、營養(yǎng)缺乏、吸煙和過度酗酒等原因會(huì)導(dǎo)致△6一脂肪酸脫氫酶活性降低，導(dǎo)致GLA合成不足，引起多種疾病。因此，必須在食物中添加外源性的GLA，但現(xiàn)有GLA商業(yè)來源難以滿足日益增長的市場(chǎng)需求，通過基因工程手段使微生物生產(chǎn)特殊的油脂是另一種重要的潛在來源。Huang等嘗試將△12和△6-脂肪酸脫氫酶在釀酒酵母（Saccha-romyces cerevisiae）和耶羅維亞酵母（Yarrowialipolytica）中共表達(dá)產(chǎn)生GLA，我們前期的工作也分別將高山被孢霉和少根根霉△6一脂肪酸脫氫酶基因?qū)氘叧嘟湍钢斜磉_(dá)，但是脂肪酸轉(zhuǎn)化率低、油含量低以及組分復(fù)雜等原因使得進(jìn)一步應(yīng)用難以推廣。作為潛在的食用油商業(yè)化來源之一，產(chǎn)油酵母其油脂成分與常見的植物油類似，不含GLA等高不飽和的PUFAs。本研究通過基因工程手段將高山被孢霉△6-脂肪酸脫氫酶基因?qū)氘a(chǎn)油酵母YM25235中進(jìn)行表達(dá)，使其產(chǎn)GLA，改良其油脂成分和營養(yǎng)價(jià)值，為將來大規(guī)模應(yīng)用打下基礎(chǔ)。